Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
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इस कार्य को MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ और "ERDP को यूरोप बनाने का एक तरीका" द्वारा वित्त पोषित प्रोजेक्ट ग्रांट RTI2018-095069-B-I00 द्वारा समर्थित किया गया था। जेएसआर को प्लान एंडालुज़ डी इन्वेस्टिगासिओन, डेसररोलो ई इनोवैसिओन (पेडी 2020) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एनएलपी को प्रोजेक्ट ग्रांट पी 18-आरटी -2398 द्वारा प्लान एंडालुज़ डी इन्वेस्टिगासियोन, डेसररोलो ई इनोवासियोन से वित्त पोषित किया गया था।

1. पौधे की तैयारी
<ol><li>नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एराबिडोप्सिस कोल -0 पौधे तैयार करें।<ol><li>10 सेमी व्यास के बर्तन को 1: 3 वर्मीक्यूलाइट-प्लांट सब्सट्रेट मिश्रण ( सामग्री की तालिका देखें) के ?...

<ol>
	<li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity:+A+bacterial+virulence+strategy.">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li><li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae.">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li><li>Rufian, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

यहां प्रस्तुत विधि एक गैर-इनवेसिव प्रक्रिया का वर्णन करती है जो पौधे के पर्ण ऊतक में बैक्टीरिया की घुसपैठ की अनुमति देती है, जिससे ऊतक व्यवधान को कम करते हुए बड़ी मात्रा में तेजी से टीकाकरण की अनुमति मि...

रोगजनक बैक्टीरिया विभिन्न फेनोटाइप्स में अंतर प्रदर्शित करते हैं, जिससे आनुवंशिक रूप से समान आबादी के भीतर उप-आबादी के गठन को जन्म मिलता है। इस घटना को फेनोटाइपिक विषमता के रूप में जाना जाता है और इसे बैक्टीरिया-होस्ट इंटरैक्शन 1 के दौरान अनुकूलन रणनीतिके रूप में प्रस्तावित किया गया है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ संयुक्त कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, फ्लो साइटोमेट्री और माइक्रोफ्लुइडिक्स के ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन में हालिया प्रगति ने बैक्टीरिया की आबादी के एकल-सेल विश्लेषण को बढ़ावा दियाहै।
ग्राम-नकारात्मक स्यूडोमोनास सिरिंगे अपने अकादमिक औरआर्थिक महत्व दोनों के कारण एक पुरातन पौधे रोगजनक बैक्टीरिया है। पी सिरिंगे का जीवन चक्र जल चक्र4 से जुड़ा हुआ है। सिरिंगे मेसोफिल कोशिकाओं, पौधे की पत्ती एपोप्लास्ट के बीच अंतरकोशिकीय रिक्त स्थान में प्रवेश करता है, प्राकृतिक एपर्चर जैसे स्टोमेटा या घाव5 के माध्यम से। एक बार एपोप्लास्ट के भीतर, पी सिरिंगे पौधे की प्रतिरक्षा को दबाने और रोगज़नक़6 के लाभ के लिए पौधे सेलुलर कार्यों में हेरफेर करने के लिए टाइप III स्राव प्रणाली (टी 3 एसएस) और टाइप III-ट्रांसलोकेटेड प्रभावकों (टी 3 ई) पर निर्भर करता है। टी 3 एसएस और टी 3 ई की अभिव्यक्ति मास्टर नियामक एचआरपीएल पर निर्भर करती है, एक वैकल्पिक सिग्मा कारक जो लक्ष्य जीन 7 के प्रमोटर क्षेत्र में एचआरपी-बॉक्स रूपांकनों को बांधताहै। 
रुचि के जीन के डाउनस्ट्रीम फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन के लिए क्रोमोसोम-स्थित ट्रांसक्रिप्शनल संलयन उत्पन्न करके, कोई एकल-कोशिका स्तर8 पर उत्सर्जित प्रतिदीप्ति स्तरों के आधार पर जीन अभिव्यक्ति की निगरानी कर सकता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, यह स्थापित किया गया है कि एचआरपीएल की अभिव्यक्ति प्रयोगशाला में उगाई गई जीवाणु संस्कृतियों के भीतर और पौधे एपोप्लास्ट 8,9 से बरामद जीवाणु आबादी के भीतर विषम है। यद्यपि एकल-कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण आमतौर पर प्रयोगशाला मीडिया में उगाए गए जीवाणु संस्कृतियों में किया जाता है, इस तरह के विश्लेषण पौधे के भीतर बढ़ने वाली जीवाणु आबादी पर भी किए जा सकते हैं, इस प्रकार प्राकृतिक संदर्भ में उप-आबादी के गठन पर मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं। पौधे से निकाली गई जीवाणु आबादी के विश्लेषण के लिए एक संभावित सीमा यह है कि एपोप्लास्ट में सिरिंज-दबाव घुसपैठ द्वारा क्लासिक टीकाकरण विधियां, इसके बाद पत्ती के ऊतकों के मैकेशन द्वारा जीवाणु निष्कर्षण, आमतौर पर बड़ी मात्रा में सेलुलर पौधे के मलबे उत्पन्न करता है जो डाउनस्ट्रीम विश्लेषण10 में हस्तक्षेप करता है। अधिकांश सेलुलर मलबे में क्लोरोप्लास्ट के ऑटोफ्लोरोसेंट टुकड़े होते हैं जो जीएफपी प्रतिदीप्ति के साथ ओवरलैप होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप भ्रामक परिणाम होते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल दो मॉडल पैथोसिस्टम में एकल-सेल जीन अभिव्यक्ति विषमता का विश्लेषण करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है: पी सिरिंगे पीवी द्वारा गठित एक। टमाटर स्ट्रेन डीसी 3000 और एराबिडोप्सिस थैलियाना (कोल -0), और दूसरा पी सिरिंगे पीवी द्वारा। फेजोलिकोला स्ट्रेन 1448 ए और बीन पौधे (फेजोलस वल्गारिस कल्टीवेटर कैनेडियन वंडर)। वैक्यूम चैंबर और पंप का उपयोग करके वैक्यूम घुसपैठ के आधार पर एक टीकाकरण विधि प्रस्तावित की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप पूरी पत्तियों में घुसपैठ करने के लिए एक तेज और क्षति मुक्त विधि होती है। इसके अलावा, पारंपरिक प्रोटोकॉल पर सुधार के रूप में, एपोप्लास्ट से बैक्टीरिया की आबादी को निकालने के लिए एक सौम्य विधि का उपयोग किया जाता है जो एक सिरिंज के भीतर मात्रा की थोड़ी मात्रा का उपयोग करके सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के चक्रों को लागू करके एपोप्लास्टिक द्रव के निष्कर्षण के आधार पर ऊतक व्यवधान को काफी कम करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

रोगजनक सूक्ष्मजीवों की अधिकता लगातार पौधों पर हमला करती है। स्यूडोमोनास सिरिंगे प्रजाति परिसर में मेजबानों की एक विस्तृत संख्या के लिए विशेष प्रासंगिकता के ग्राम-नकारात्मक पौधे-रोगजनक बैक्टीरिया शामिल हैं। सिरिंगे पत्ती की सतह से पौधे में प्रवेश करता है और एपोप्लास्ट के भीतर तेजी से बढ़ता है, जिससे माइक्रोकलोनियां बनती हैं जो अंतरकोशिकीय स्थान पर कब्जा कर लेती हैं। बैक्टीरिया द्वारा फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संवैधानिक अभिव्यक्ति सूक्ष्म उपनिवेशों के विज़ुअलाइज़ेशन और सूक्ष्म स्तर पर संक्रमण के विकास की निगरानी की अनुमति देती है। एकल-कोशिका विश्लेषण में हालिया प्रगति ने क्लोनल इसोजेनिक जीवाणु आबादी द्वारा पहुंचने वाली बड़ी जटिलता का खुलासा किया है। यह जटिलता, जिसे फेनोटाइपिक विषमता के रूप में जाना जाता है, बैक्टीरिया समुदाय के बीच जीन अभिव्यक्ति (आनुवंशिक अंतर से जुड़ा नहीं) में सेल-टू-सेल अंतर का परिणाम है। एकल-कोशिका स्तर पर व्यक्तिगत लोकी की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के ट्रांसक्रिप्शनल संलयन का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। तनाव की स्थिति में, जैसे कि पौधे के एपोप्लास्ट के औपनिवेशीकरण के दौरान होने वाली, पी सिरिंगे प्रमुख विषाणु जीन (यानी, एचआरपी टाइप III स्राव प्रणाली) की विषम अभिव्यक्ति के आधार पर अलग-अलग उप-आबादी में अंतर करता है। हालांकि, पौधे के ऊतकों से बरामद किसी भी पी सिरिंगे आबादी का एकल-कोशिका विश्लेषण टीकाकरण और जीवाणु निष्कर्षण प्रक्रियाओं के लिए आंतरिक यांत्रिक व्यवधान के दौरान जारी सेलुलर मलबे के कारण चुनौतीपूर्ण है। वर्तमान रिपोर्ट में एराबिडोप्सिस और बीन पौधों के उपनिवेशीकरण के दौरान एकल-कोशिका स्तर पर रुचि के पी सिरिंगे जीन की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए विकसित एक विधि का विवरण दिया गया है। वैक्यूम कक्ष का उपयोग करके टीकाकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले पौधों की तैयारी और जीवाणु निलंबन का वर्णन किया गया है। एपोप्लास्टिक द्रव निष्कर्षण द्वारा संक्रमित पत्तियों से एंडोफाइटिक बैक्टीरिया की वसूली भी यहां बताई गई है। बैक्टीरियल टीकाकरण और जीवाणु निष्कर्षण विधियों दोनों को पौधे और जीवाणु कोशिका क्षति को कम करने के लिए अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए इष्टतम जीवाणु तैयारी होती है।

पौधे के भीतर जीवाणु वृद्धि के लिए टाइप III स्राव प्रणाली की अभिव्यक्ति आवश्यक है। टी 3 एसएस जीन की समय पर अभिव्यक्ति जटिल विनियमन के माध्यम से प्राप्त की जाती है, जिसके केंद्र में एक्स्ट्रासाइटोप्लाज्मि...

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Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

वर्तमान प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करता है जो पौधे के एपोप्लास्ट के भीतर उगाए गए स्यूडोमोनास सिरिंगे आबादी पर एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की अनुमति देता है।

पौधे के ऊतक के भीतर स्यूडोमोनास सिरिंगे जीन की अभिव्यक्ति का एकल-कोशिका विश्लेषण

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

हमारा प्रोटोकॉल एक सौम्य पौधे टीकाकरण और निष्कर्षण विधि प्रदान करता है जो फ्लो साइटोमेट्री जैसे एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयुक्त पत्ती एपोप्लास्ट में उगाए गए जीवाणु आबादी को पुनर्प्राप्त करने की अनुमति देता है। यह विधि पौधे सेलुलर मलबे के साथ नमूनों को काफी दूषित किए बिना एपोप्लास्ट से काफी मात्रा में बैक्टीरिया के निष्कर्षण की अनुमति देती है। एपोप्लास्टिक बैक्टीरिया की वसूली के लिए इस अनुकूलित विधि को सीधे या कई पौधों के जीवाणु प्रणालियों में मामूली संशोधनों के साथ लागू किया जा सकता है जिसमें या तो पौधे रोगजनक बैक्टीरिया या लाभकारी एंडोसाइटिक बैक्टीरिया शामिल हैं।प्रक्रिया का प्रदर्शन हमारी प्रयोगशाला से पीएचडी छात्र नीव्स लोपेज़-पगन करेंगे। शुरू करने के लिए, पहले से पानी वाले 1: 3 वर्मीक्यूलाइट प्लांट सब्सट्रेट मिश्रण के साथ 10 सेंटीमीटर व्यास के बर्तन भरें। बर्तन को छिद्रित धातु जाल के साथ कवर करें और रबर बैंड का उपयोग करके धातु जाल को गीली मिट्टी में समायोजित करें।इसके बाद, एराबिडोप्सिस के बीज को गीले टूथपिक के साथ धातु जाल के छेद में बोएं। बर्तन के भीतर दूर की स्थिति में तीन से चार बीज रखें। उच्च सापेक्ष आर्द्रता बनाए रखने के लिए बर्तन को प्लास्टिक गुंबद के साथ कवर करें और 72 घंटों के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर स्तरीकरण के लिए इनक्यूबेट करें।गमले को अल्पकालिक परिस्थितियों में पौधे के विकास कक्ष में स्थानांतरित करें। बर्तन को उजागर करने के लिए, प्लास्टिक गुंबद को हटा दें। एक बार बीज अंकुरित हो जाने के बाद, अधिकांश रोपाई को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें, बर्तन की प्रत्येक स्थिति में एक अंकुर रखें।फिर पेपर टॉवल के गीले टुकड़े के साथ पेट्री डिश के तल को कवर करके और उसके ऊपर बीन के बीज रखकर फेजोलस वल्गारिस बीन पौधे तैयार करें। पेट्री डिश को सर्जिकल टेप के साथ सील करें और तीन से चार दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अंकुरित बीजों को गीले 1: 3 वर्मीक्यूलाइट प्लांट सब्सट्रेट मिश्रण से भरे 10 सेंटीमीटर व्यास के बर्तन में स्थानांतरित करें और लंबे समय तक सेटिंग्स के तहत पौधे के विकास कक्ष में इनक्यूबेट करें।स्यूडोमोनास सिरिंगे स्ट्रेन के ग्लिसरॉल स्टॉक को माइनस 80 डिग्री सेल्सियस से एलबी प्लेट में उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक करें। प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस पर 40 से 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। बैक्टीरियल बायोमास को खुरचें और इसे 10-मिलीमोलर मैग्नीशियम क्लोराइड के पांच मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें।600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें और 10-मिलीमीटर मैग्नीशियम क्लोराइड जोड़कर इसे 0.1 में समायोजित करें। प्रति मिलीलीटर पांचवें सीएफयू से पांच गुना 10 गुना अंतिम इनोकुलम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10-मिलीमोलर मैग्नीशियम क्लोराइड में सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। फिर, एराबिडोप्सिस पौधों के लिए 200 मिलीलीटर इनोकुलम और बीन पौधों के लिए 50 मिलीलीटर तैयार करें।टीकाकरण से पहले, सर्फेक्टेंट सिलवेट एल -77 को बीन टीकाकरण के लिए 0.02% और एराबिडोप्सिस के लिए 0.01% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। एराबिडोप्सिस घुसपैठ के लिए, बर्तन के ऊपर एक एक्स बनाने वाली दो लकड़ी की छड़ें रखें और बर्तन को 14 सेंटीमीटर व्यास के पेट्री डिश के सामने रखें जिसमें 200 मिलीलीटर इनोकुलम हो। बीन के पत्तों के टीकाकरण के लिए, पौधों और इनोकुलम समाधान को वैक्यूम कक्ष में डालें और पत्ती को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पेश करें जिसमें इनोकुलम होता है।पत्तियों में घुसपैठ करने के लिए 30 सेकंड के लिए 500 मिलीबार की दाल दें। अतिरिक्त इनोकुलम समाधान को कागज के एक टुकड़े के साथ निकालें और योजनाओं को उनके संबंधित विकास कक्ष में वापस कर दें। टीकाकरण के चार दिन बाद, एराबिडोप्सिस पौधे के हवाई हिस्से या सेम के पौधे से टीका लगाए गए पत्ते को काट लें और इसे सुई के बिना 20 मिलीलीटर सिरिंज में रखें।बीन के पत्तों के लिए, पत्ती को अपने आप रोल करें, अक्षीय चेहरे को बाहर की ओर छोड़ दें। ऊतक को कवर करने के लिए आसुत जल की पर्याप्त मात्रा जोड़ें। फिर, सिरिंज को एक सीधी स्थिति में पकड़ने वाले प्लंजर डालें और बैरल को धीरे से टैप करके सिरिंज के अंदर अतिरिक्त हवा और हवा के बुलबुले को हटा दें जब तक कि सभी हवा नोक के पास स्थित न हो, और हवा को हटाने के बाद, सिरिंज बैरल की नोक को पैराफिन फिल्म के साथ कवर करें।अब सकारात्मक दबाव उत्पन्न करने के लिए प्लंजर को ध्यान से दबाएं जब तक कि ऊतक गहरा न हो जाए। फिर, नकारात्मक दबाव उत्पन्न करने के लिए प्लंजर को खींचें। पैराफिन फिल्म और प्लंजर को हटा दें और एपोप्लास्ट-निकाले गए बैक्टीरिया युक्त तरल पदार्थ एकत्र करें।एकल-कोशिका विश्लेषण के लिए, आसुत जल में 1.5% अगारोस समाधान तैयार करें। पिघलने के बाद, दो माइक्रोस्कोपी स्लाइडों के बीच की जगह को भरने के लिए पर्याप्त मात्रा जोड़ें और शीर्ष पर एक और स्लाइड रखें। उन्हें 15 मिनट तक ड्राइव करने दें और शीर्ष पर रखी स्लाइड को ध्यान से हटा दें।ब्लेड का उपयोग करके, उपयोग करने से पहले अगारोस पैड को पांच मिलीमीटर के टुकड़ों से पांच मिलीमीटर में काट लें। समानांतर रूप से, एपोप्लास्ट-निकाले गए बैक्टीरिया का एक मिलीमीटर सेंट्रीफ्यूज। पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें और कोशिकाओं को केंद्रित करने के लिए गोली को 20 माइक्रोलीटर पानी में फिर से निलंबित करें।0.17 मिलीमीटर कवर स्लिप पर केंद्रित कोशिकाओं की दो-माइक्रोलीटर बूंद रखें और ड्रॉप को अगारोस पैड के एक टुकड़े से कवर करें। विशिष्ट लेजर का उपयोग करके हरे फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत बैक्टीरिया की तैयारी की कल्पना करें। उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग करके सभी बैक्टीरिया की पहचान करें और दोनों क्षेत्रों को विलय करें।फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करने के लिए, एपोप्लास्ट-निकाले गए बैक्टीरिया निलंबन का एक एलिकोट लें। प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके विश्लेषण करें और 100, 000 घटनाओं का अधिग्रहण करें। एचआरपीएल जीएफपी की अभिव्यक्ति की निगरानी जीएफपी प्रतिदीप्ति द्वारा की जाती है।डॉट प्लॉट ग्राफ आबादी में जीएफपी बनाम सेल आकार के प्रतिदीप्ति तीव्रता वितरण को दिखाते हैं, जबकि हिस्टोग्राम जीएफपी बनाम सेल गणना की प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाते हैं। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां एचआरपीएल की अभिव्यक्ति से जुड़े जीएफपी के विषम स्तर दिखाती हैं।कम या कोई जीएफपी प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने वाले बैक्टीरिया देखे जाते हैं। इष्टतम परिणामों के लिए, पौधे के ऊतकों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए बैक्टीरिया निष्कर्षण चरणों के दौरान सौम्य रहें और इस प्रकार पौधे सेलुलर सामग्री से संदूषण को सीमित करें। प्राप्त बैक्टीरिया के नमूनों का उपयोग अन्य उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है जहां पौधे के संदूषण को कम करना एक फायदा है, जैसे कि बाद में जीवाणु जीनोमिक या ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण।

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

सिंगल सेल electroporation vivo में बरकरार विकासशील मस्तिष्क के भीतर

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

रोबोटिक और जीन एक्सप्रेशन के संयंत्र के ऊतकों में अध्ययन के लिए गतिशील छवि विश्लेषण

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

सक्रिय टी. के पुनर्गठन इन विट्रो में castaneum टेलोमिरेज

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

स्तनधारी Linker histone subtypes की अभिव्यक्ति विश्लेषण

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी जांच और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण: organelle वफ़ादारी में शामिल जीनों की पहचान के लिए उपयोगी उपकरण

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia निम्नलिखित एकल कोशिका के स्तर पर ग्लोबल शाही सेना संश्लेषण का विश्लेषण

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

एक MAPK संकेतन मार्ग के स्थानिक पुनर्गठन तंबाकू क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग इमेजिंग

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

घन प्रोटोकॉल पूरा पर्वत त्वचा तैयारी में एकल कक्ष संकल्प पर प्रोटीन अभिव्यक्ति visualizes

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ Stromule फ्रीक्वेंसी Visualizing

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

प्रसव के बाद चूहों में श्रवण बुल्ला की विच्छेदन: मध्यम कान हड्डियों और histological विश्लेषण के अलगाव

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...