Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Project Grant RTI2018-095069-B-I00 finansiert av MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ og av "ERDP A way of making Europe". J.S.R. ble finansiert av Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. ble finansiert av Project Grant P18-RT-2398 fra Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. Plant forberedelse
<ol><li>Forbered Arabidopsis Col-0 planter ved å følge trinnene nedenfor.<ol><li>Fyll en gryte med en 10 cm diameter pott med en 1: 3 vermikulitt-plante substratblanding (se materialfortegnelse), tidligere vannet, og dekk potten med et 15 cm x 15 cm metallnett med 1,6 mm x 1,6 mm hull. Juster metallnettet til den våte jorden ved hjelp av et gummibånd (figur 1A).</li>
		<li>Med en våt tannpirker, så Arabidopsis frø inn i hullene...

<ol>
	<li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity:+A+bacterial+virulence+strategy.">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li><li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters.">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle.">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic,+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains.">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li><li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors:+Beyond+suppression+of+immunity.">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li><li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae.">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae.">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li><li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host.">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).</li><li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor.">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li><li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robust Statistics. , (1981).</li><li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae:+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization.">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem.">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).</li><li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).</li><li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

Metoden som presenteres her beskriver en ikke-invasiv prosedyre som tillater infiltrering av bakterier i plantebladvevet, noe som muliggjør rask inokulering av store volumer samtidig som vevsforstyrrelser minimeres. Et av egenskapene til P. syringae-artskomplekset er evnen til å overleve og proliferere inne i planteapoplasten og på planteoverflaten som epifyt14. Dermed kan muligheten for at bakteriene ekstrahert ved hjelp av denne protokollen bare kommer fra planten apoplast ikke utelu...

Patogene bakterier viser forskjeller i forskjellige fenotyper, noe som gir opphav til dannelse av underpopulasjoner innenfor genetisk identiske populasjoner. Dette fenomenet er kjent som fenotypisk heterogenitet og har blitt foreslått som en tilpasningsstrategi under bakterie-vert-interaksjoner1. Nylige fremskritt i optisk oppløsning av konfokale mikroskoper, flowcytometri og mikrofluidikk, kombinert med fluorescerende proteiner, har fostret enkeltcelleanalyser av bakteriepopulasjoner2.
Den gramnegative Pseudomonas syringae er en arketypisk plantepatogen bakterie på grunn av både dens faglige og økonomiske betydning3. Livssyklusen til P. syringae er knyttet til vannets kretsløp4. P. syringae kommer inn i de intercellulære mellomrommene mellom mesofyllcellene, plantebladapoplasten, gjennom naturlige åpninger som stomata eller sår5. En gang i apoplasten er P. syringae avhengig av type III-sekresjonssystemet (T3SS) og type III-translokerte effektorer (T3E) for å undertrykke planteimmunitet og manipulere plantecellulære funksjoner til fordel for patogenet6. Uttrykket av T3SS og T3E avhenger av masterregulatoren HrpL, en alternativ sigmafaktor som binder seg til hrp-boksmotivene i promotorregionen til målgenene7. 
Ved å generere kromosomlokaliserte transkripsjonsfusjoner til fluorescerende proteingener nedstrøms for genet av interesse, kan man overvåke genuttrykk basert på fluorescensnivåene som sendes ut på enkeltcellenivå8. Ved hjelp av denne metoden har det blitt fastslått at uttrykket av hrpL er heterogent både innenfor bakteriekulturer dyrket i laboratoriet og innenfor bakteriepopulasjoner gjenvunnet fra planten apoplast 8,9. Selv om genekspresjonsanalyse på enkeltcellenivå vanligvis utføres i bakteriekulturer dyrket i laboratoriemedier, kan slike analyser også utføres på bakteriepopulasjoner som vokser i planten, og gir dermed verdifull informasjon om dannelsen av underpopulasjoner i naturlig sammenheng. En potensiell begrensning for analysen av bakteriepopulasjoner ekstrahert fra planten er at klassiske inokulasjonsmetoder ved sprøytetrykkinfiltrasjon i apoplasten, etterfulgt av bakteriell ekstraksjon ved maserasjon av bladvevet, vanligvis genererer en stor mengde cellulært planteavfall som forstyrrer nedstrømsanalyse10. De fleste cellulære rusk består av autofluorescerende fragmenter av kloroplaster som overlapper med GFP-fluorescens, noe som resulterer i misvisende resultater.
Den foreliggende protokollen beskriver prosessen med å analysere encellet genuttrykksheterogenitet i to modellpatosystemer: den som dannes av P. syringae pv. tomatstamme DC3000 og Arabidopsis thaliana (Col-0), og den andre av P. syringae pv. phaseolicola stamme 1448A og bønneplanter (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). En inokulasjonsmetode foreslås basert på vakuuminfiltrasjon ved hjelp av et vakuumkammer og en pumpe, noe som resulterer i en rask og skadefri metode for å infiltrere hele blader. Videre, som en forbedring av konvensjonelle protokoller, brukes en mildere metode for å trekke ut bakteriepopulasjonen fra apoplasten som signifikant reduserer vevsforstyrrelser, basert på ekstraksjon av apoplastisk væske ved å anvende sykluser med positivt og negativt trykk ved hjelp av en liten mengde volum i en sprøyte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

En mengde patogene mikroorganismer angriper stadig planter. Artskomplekset Pseudomonas syringae omfatter gramnegative plantepatogene bakterier av spesiell relevans for et stort antall verter. P. syringae kommer inn i planten fra bladoverflaten og multipliserer raskt i apoplasten, og danner mikrokolonier som opptar det intercellulære rommet. Det konstitutive uttrykket av fluorescerende proteiner av bakteriene muliggjør visualisering av mikrokoloniene og overvåking av utviklingen av infeksjonen på mikroskopisk nivå. Nylige fremskritt innen enkeltcelleanalyse har avslørt den store kompleksiteten som nås av klonale isogene bakteriepopulasjoner. Denne kompleksiteten, referert til som fenotypisk heterogenitet, er konsekvensen av celle-til-celle-forskjeller i genuttrykk (ikke knyttet til genetiske forskjeller) blant bakteriesamfunnet. For å analysere uttrykket av individuelle loci på enkeltcellenivå, har transkripsjonsfusjoner til fluorescerende proteiner blitt mye brukt. Under stressforhold, som de som oppstår under kolonisering av planteapoplasten, skiller P. syringae seg ut i forskjellige subpopulasjoner basert på det heterogene uttrykket av viktige virulensgener (dvs. Hrp type III sekresjonssystem). Imidlertid er enkeltcelleanalyse av en gitt P. syringae-populasjon gjenvunnet fra plantevev utfordrende på grunn av det cellulære rusket som frigjøres under den mekaniske forstyrrelsen som er iboende for inokulasjons- og bakterieekstraksjonsprosessene. Denne rapporten beskriver en metode utviklet for å overvåke ekspresjonen av P. syringae-gener av interesse på enkeltcellenivå under koloniseringen av Arabidopsis og bønneplanter. Fremstillingen av plantene og bakterielle suspensjoner som brukes til inokulering ved hjelp av et vakuumkammer er beskrevet. Utvinningen av endofytiske bakterier fra infiserte blader ved apoplastisk væskeekstraksjon er også forklart her. Både bakteriell inokulasjon og bakteriell ekstraksjonsmetoder er empirisk optimalisert for å minimere plante- og bakteriell celleskade, noe som resulterer i bakterielle preparater som er optimale for mikroskopi og flowcytometrianalyse.

Ekspresjonen av type III-sekresjonssystemet er avgjørende for bakterievekst i planten. Det rettidige uttrykket av T3SS-gener oppnås gjennom intrikat regulering, i sentrum av hvilken er den ekstracytoplasmatiske funksjonen (ECF) sigmafaktor HrpL, nøkkelaktivatoren for ekspresjonen av T3SS-relaterte gener11. En analyse av ekspresjonen av hrpL ble tidligere utført ved hjelp av en kromosomlokalisert transkripsjonsfusjon til et nedstrøms promotorløst gfp-gen og ved å følge eks...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Den nåværende protokollen beskriver en metode som tillater enkeltcellegenuttrykksanalyse på Pseudomonas syringae-populasjoner dyrket i planten apoplast.

Enkeltcelleanalyse av ekspresjonen av Pseudomonas syringae-gener i plantevevet

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Vår protokoll gir en skånsom planteinokulasjons- og ekstraksjonsmetode som gjør det mulig å gjenopprette bakteriepopulasjoner dyrket i bladapoplasten, egnet for enkeltcellegenuttrykksanalyse, for eksempel flowcytometri. Denne metoden tillater ekstraksjon av en betydelig mengde bakterier fra apoplasten uten å forurense prøvene betydelig med plantecellulært rusk. Denne optimaliserte metoden for apoplastisk bakterieutvinning kan brukes direkte eller med mindre modifikasjoner på en rekke plantebakterielle systemer som omfatter enten plantepatogene bakterier eller gunstige endocytiske bakterier.Demonstrere prosedyren vil være Nieves Lopez-Pagan, en Ph.D-student fra vårt laboratorium. For å begynne, fyll en gryte på 10 centimeter i diameter med tidligere vannet 1: 3 vermikulitt plantesubstratblanding. Dekk potten med et perforert metallnett og juster metallnettet til den våte jorden ved hjelp av et gummibånd.Deretter sår du Arabidopsisfrø inn i hullene i metallnettet med en våt tannpirker. Plasser tre til fire frø i fjerne posisjoner i potten. Dekk potten med en plastkuppel for å opprettholde høy relativ fuktighet og inkuber for stratifisering ved fire grader Celsius i 72 timer.Overfør potten til et plantevekstkammer under kortdagsforhold. For å avdekke potten, fjern plastkuppelen. Når frøene er spiret, bruk pinsetten til å fjerne de fleste plantene, og hold en frøplante i hver av pottens posisjoner.Forbered deretter Phaseolus vulgaris bønneplanter ved å dekke bunnen av en petriskål med et vått stykke papirhåndkle og plassere bønnefrøene på toppen av det. Forsegl petriskålen med kirurgisk tape og rug ved 28 grader Celsius i tre til fire dager. Overfør de spirede frøene til en potte på 10 centimeter i diameter fylt med våt 1: 3 vermikulittplantesubstratblanding og inkuber i et plantevekstkammer under langdagsinnstillinger.Strek ut glyserollageret av Pseudomonas syringae-stamme av interesse fra minus 80 grader Celsius til en LB-plate supplert med passende antibiotika. Inkuber platen ved 28 grader Celsius i 40 til 48 timer. Skrap bakteriell biomasse og resuspender den i fem milliliter 10 millimolar magnesiumklorid.Mål den optiske tettheten ved 600 nanometer og juster den til 0,1 ved å tilsette 10 millimolært magnesiumklorid. Utfør serielle fortynninger i 10 millimolar magnesiumklorid for å få en endelig inokulumkonsentrasjon på fem ganger 10 til femte CFU per milliliter. Deretter forbereder du 200 ml inokulum for Arabidopsis-plantene og 50 ml for bønneplantene.Før inokulering, tilsett overflateaktivt middel Silwet L-77 til en endelig konsentrasjon på 0,02% for bønneinokulasjon og 0,01% for Arabidopsis. For Arabidopsis infiltrasjon, plasser to trepinner som danner en X over potten og legg potten vendt ned over en 14 centimeter diameter petriskål som inneholder 200 ml inokulum. For bønnebladinokulering, sett plantene og inokulumoppløsningen inn i et vakuumkammer og introduser bladet i et 50 milliliter konisk sentrifugerør som inneholder inokulumet.Gi en puls på 500 millibar i 30 sekunder for å infiltrere bladene. Tøm overflødig inokulumoppløsning med et stykke papir og returner planene til deres tilsvarende vekstkammer. Fire dager etter inokulering, kutt enten luftdelen av Arabidopsis-anlegget eller det inokulerte bladet fra bønneplanten og legg det i en 20 milliliter sprøyte uten nål.For bønneblader, rull bladet på seg selv, og la det abaxiale ansiktet utover. Tilsett nok volum destillert vann til å dekke vevet. Sett deretter stempelet som holder sprøyten loddrett og fjern overflødig luft og luftbobler inne i sprøyten ved å banke forsiktig på sylinderen til all luften er plassert nær spissen, og dekk spissen av sprøytesylinderen med parafinfilm etter å ha fjernet luften.Trykk forsiktig på stempelet for å generere positivt trykk til vevet blir mørkere. Trekk deretter i stempelet for å generere undertrykk. Fjern parafinfilmen og stempelet og samle væsken som inneholder apoplast-ekstraherte bakterier.For en enkeltcelleanalyse, lag en 1,5% agaroseoppløsning i destillert vann. Når smeltet, legg til nok volum til å fylle mellomrommet mellom to mikroskopilysbilder satt side om side og plasser et annet lysbilde på toppen. La dem kjøre i 15 minutter og fjern lysbildet som er plassert på toppen forsiktig.Bruk et blad til å kutte agaroseputen i fem millimeter med fem millimeter stykker før bruk. Parallelt, sentrifuge en millimeter av de apoplastekstraherte bakteriene. Fjern forsiktig supernatanten med en pipette og resuspender pelleten i 20 mikroliter vann for å konsentrere cellene.Plasser en to-mikroliters dråpe av de konsentrerte cellene på en 0,17 millimeter dekselslipp og dekk dråpen med et stykke agarosepute. Visualiser bakteriepreparatet under konfokalmikroskopet for å identifisere grønne fluorescerende bakterier ved hjelp av spesifikke lasere. Identifiser alle bakteriene ved hjelp av lysfeltet og slå sammen begge feltene.For å utføre analyse ved flowcytometri, ta en alikot av de apoplastekstraherte bakteriesuspensjonene. Analyser ved hjelp av strømningscytometeret og oppnå 100.000 hendelser. Ekspresjon av hrpL GFP overvåkes av GFP-fluorescens.Punktplottgrafene viser fluorescensintensitetsfordelingen av GFP versus cellestørrelse i befolkningen, mens histogrammene viser fluorescensintensiteten av GFP versus celletall. HRPL ON-prosentene var høyere enn de tilsvarende prosentandelene av hrpL OFF. Fluorescensmikroskopibilder viser heterogene nivåer av GFP assosiert med uttrykket av hrpL.Bakteriene som viser lav eller ingen GFP-fluorescens observeres. For optimale resultater, vær forsiktig under bakterieutvinningstrinnene for å unngå å skade plantevevet og dermed begrense forurensning fra plantecellulært innhold. De oppnådde bakterieprøvene kan brukes til andre formål der reduksjon av planteforurensning er en fordel, for eksempel nukleinsyreekstraksjoner for påfølgende bakteriell genomisk eller transkriptomisk analyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Expression Analyse av pattedyrs Linker-histone Subtyper

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening og neste generasjons sekvensering: Nyttige verktøy for identifikasjon av gener involvert i Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Spatial Omorganisering av et MAPK signalveien Bruke Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC Protocol Visualiserer Protein Expression på enkelt celle oppløsning i Hele Mount hud preparater

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule Frequency med Fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Disseksjon av det auditive Bulla i barsel Mus: Isolering av mellomøret Bein og histologisk analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...