Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом проекта RTI2018-095069-B-I00, финансируемым MCIN/AEI/10.13039/501100011033/, и «ERDP: способ сделать Европу». J.S.R. финансировался Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. финансировался за счет гранта проекта P18-RT-2398 от Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. Подготовка растений
<ol><li>Подготовьте растения Arabidopsis Col-0, выполнив следующие действия.<ol><li>Заполните горшок диаметром 10 см предварительно политой смесью субстрата из вермикулита и растений (см. Таблицу материалов) и накройте горшок металлической сеткой размером 15 ?...

<ol>
	<li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity:+A+bacterial+virulence+strategy.">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li><li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters.">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle.">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic,+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains.">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li><li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors:+Beyond+suppression+of+immunity.">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li><li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae.">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae.">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li><li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host.">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).</li><li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor.">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li><li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robust Statistics. , (1981).</li><li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae:+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization.">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem.">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).</li><li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).</li><li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

Представленный здесь способ описывает неинвазивную процедуру, которая позволяет инфильтрации бактерий в ткани листвы растений, что позволяет быстро инокуляцию больших объемов, сводя к минимуму разрушение тканей. Одной из характеристик видового комплекса P. syringae является способн...

Патогенные бактерии проявляют различия в различных фенотипах, что приводит к образованию субпопуляций в генетически идентичных популяциях. Это явление известно как фенотипическая гетерогенность и было предложено в качестве стратегии адаптации во время взаимодействия бактерий с хозяином1. Последние достижения в области оптического разрешения конфокальных микроскопов, проточной цитометрии и микрофлюидики в сочетании с флуоресцентными белками способствовали одноклеточному анализу бактериальных популяций2.
Грамотрицательная синегнойная палочка Pseudomonas syringae является архетипической патогенной бактерией растений из-за ее академического и экономического значения3. Жизненный цикл P. syringae связан с водным циклом4. P. syringae проникает в межклеточные промежутки между клетками мезофилла, апопластом листа растения, через естественные отверстия, такие как устьица или раны5. Попав в апопласт, P. syringae полагается на систему секреции III типа (T3SS) и транслоцированные эффекторы III типа (T3E) для подавления иммунитета растений и манипулирования клеточными функциями растений в интересах патогена6. Экспрессия T3SS и T3E зависит от главного регулятора HrpL, альтернативного сигма-фактора, который связывается с мотивами hrp-бокса в промоторной области генов-мишеней7. 
Генерируя расположенные в хромосомах слияния транскрипции с генами флуоресцентных белков ниже по течению от интересующего гена, можно контролировать экспрессию генов на основе уровней флуоресценции, испускаемых на уровне8 отдельных клеток. С помощью этого метода установлено, что экспрессия hrpL неоднородна как в бактериальных культурах, выращенных в лаборатории, так и в бактериальных популяциях, извлеченных из растительного апопласта 8,9. Хотя анализ экспрессии генов на уровне отдельных клеток обычно проводится в бактериальных культурах, выращенных в лабораторных средах, такие анализы также могут проводиться на бактериальных популяциях, растущих внутри растения, что дает ценную информацию о формировании субпопуляций в естественном контексте. Потенциальным ограничением для анализа бактериальных популяций, извлеченных из растения, является то, что классические методы инокуляции путем инфильтрации под давлением шприца в апопласт с последующей бактериальной экстракцией путем мацерации ткани листа обычно генерируют большое количество клеточных растительных остатков, которые мешают последующему анализу10. Большая часть клеточного мусора состоит из автофлуоресцентных фрагментов хлоропластов, которые перекрываются флуоресценцией GFP, что приводит к вводящим в заблуждение результатам.
Настоящий протокол описывает процесс анализа гетерогенности экспрессии одноклеточных генов в двух модельных патосистемах: той, которая сформирована P. syringae pv. штамм томатов DC3000 и Arabidopsis thaliana (Col-0), а другой - P. syringae pv. фазоликола штамма 1448А и бобовые растения (сорт Phaseolus vulgaris Canadian Wonder). Предложен метод инокуляции, основанный на вакуумной инфильтрации с использованием вакуумной камеры и насоса, что позволяет быстро и без повреждений проникать в целые листья. Кроме того, в качестве улучшения по сравнению с традиционными протоколами используется более щадящий метод извлечения бактериальной популяции из апопласта, который значительно уменьшает разрушение тканей, основанный на извлечении апопластической жидкости путем применения циклов положительного и отрицательного давления с использованием небольшого объема в шприце.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

Множество патогенных микроорганизмов постоянно атакуют растения. Видовой комплекс Pseudomonas syringae включает грамотрицательные растительно-патогенные бактерии, имеющие особое значение для широкого круга хозяев. P. syringae проникает в растение с поверхности листа и быстро размножается внутри апопласта, образуя микроколонии, занимающие межклеточное пространство. Конститутивная экспрессия флуоресцентных белков бактериями позволяет визуализировать микроколонии и отслеживать развитие инфекции на микроскопическом уровне. Последние достижения в области анализа отдельных клеток выявили большую сложность, достигаемую клональными изогенными бактериальными популяциями. Эта сложность, называемая фенотипической гетерогенностью, является следствием межклеточных различий в экспрессии генов (не связанных с генетическими различиями) среди бактериального сообщества. Для анализа экспрессии отдельных локусов на одноклеточном уровне широко использовались транскрипционные слияния с флуоресцентными белками. В стрессовых условиях, таких как те, которые возникают во время колонизации растительного апопласта, P. syringae дифференцируется в отдельные субпопуляции, основанные на гетерогенной экспрессии ключевых генов вирулентности (т.е. системы секреции Hrp типа III). Тем не менее, одноклеточный анализ любой данной популяции P. syringae , извлеченной из растительной ткани, затруднен из-за клеточного мусора, высвобождаемого во время механического разрушения, присущего процессам инокуляции и бактериальной экстракции. В настоящем докладе подробно описывается метод, разработанный для мониторинга экспрессии генов P. syringae , представляющих интерес, на одноклеточном уровне во время колонизации арабидопсиса и бобовых растений. Описана подготовка растений и бактериальных суспензий, используемых для инокуляции с помощью вакуумной камеры. Здесь также объясняется восстановление эндофитных бактерий из зараженных листьев путем экстракции апопластической жидкости. Методы бактериальной инокуляции и бактериальной экстракции эмпирически оптимизированы для минимизации повреждения растений и бактериальных клеток, в результате чего получаются бактериальные препараты, оптимальные для микроскопии и анализа проточной цитометрии.

Экспрессия системы секреции III типа имеет важное значение для роста бактерий в растении. Своевременная экспрессия генов T3SS достигается за счет сложной регуляции, в центре которой находится экстрацитоплазматический функционал (ECF) сигма-фактор HrpL, ключевой активатор экспрессии генов, с...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

В настоящем протоколе описывается способ, который позволяет проводить анализ экспрессии одноклеточных генов в популяциях Pseudomonas syringae , выращенных в апопласте растения.

Одноклеточный анализ экспрессии генов Pseudomonas syringae в растительной ткани

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Наш протокол обеспечивает щадящий метод инокуляции и экстракции растений, который позволяет восстанавливать бактериальные популяции, выращенные в листовом апопласте, подходящем для анализа экспрессии одноклеточных генов, такого как проточная цитометрия. Этот метод позволяет извлекать значительное количество бактерий из апопласта без значительного загрязнения образцов растительными клеточными остатками. Этот оптимизированный метод восстановления апопластических бактерий может быть применен непосредственно или с незначительными изменениями к ряду растительных бактериальных систем, включающих либо растительные патогенные бактерии, либо полезные эндоцитарные бактерии.Продемонстрирует процедуру Ньевес Лопес-Паган, аспирант нашей лаборатории. Для начала заполните горшок диаметром 10 сантиметров предварительно политой смесью субстрата для растений вермикулита в соотношении 1:3. Накройте горшок перфорированной металлической сеткой и приспособьте металлическую сетку к влажной почве с помощью резинки.Далее посейте семена арабидопсиса в отверстия металлической сетки влажной зубочисткой. Поместите три-четыре семени в отдаленные места в горшке. Накройте горшок пластиковым куполом для поддержания высокой относительной влажности и инкубируйте для стратификации при четырех градусах Цельсия в течение 72 часов.Перенесите горшок в камеру для выращивания растений в условиях короткого дня. Чтобы открыть горшок, снимите пластиковый купол. Как только семена прорастут, пинцетом удалите большую часть рассады, оставив по одному саженцу в каждом из положений горшка.Затем подготовьте растения фасоли Phaseolus vulgaris, накрыв дно чашки Петри влажным бумажным полотенцем и положив на него семена фасоли. Запечатайте чашку Петри хирургической лентой и инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия в течение трех-четырех дней. Перенесите пророщенные семена в горшок диаметром 10 сантиметров, наполненный влажной смесью субстрата для растений с вермикулитом в соотношении 1:3, и инкубируйте в камере для выращивания растений в условиях длительного дня.Вылейте запас глицерина интересующего штамма Pseudomonas syringae при температуре от минус 80 градусов по Цельсию в пластину LB, дополненную соответствующими антибиотиками. Инкубируйте тарелку при температуре 28 градусов Цельсия в течение 40-48 часов. Соскребите бактериальную биомассу и ресуспендируйте ее в пяти миллилитрах 10-миллимолярного хлорида магния.Измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах и отрегулируйте ее до 0,1, добавив 10-миллимолярный хлорид магния. Выполняйте последовательные разведения в 10-миллимолярном хлориде магния, чтобы получить конечную концентрацию инокулята от пяти раз до 10 до пятого КОЕ на миллилитр. Затем подготовьте 200 миллилитров инокулята для растений арабидопсиса и 50 миллилитров для бобовых растений.Перед инокуляцией добавьте поверхностно-активное вещество Silwet L-77 до конечной концентрации 0,02% для инокуляции фасоли и 0,01% для арабидопсиса. Для инфильтрации арабидопсиса поместите две деревянные палочки, образующие крестик, над горшком и поместите горшок лицевой стороной вниз на чашку Петри диаметром 14 сантиметров, содержащую 200 миллилитров инокулята. Для инокуляции листьев фасоли вставьте растения и раствор инокулята в вакуумную камеру и введите лист в 50-миллилитровую коническую центрифужную трубку, содержащую инокулят.Дайте импульс 500 миллибар в течение 30 секунд, чтобы проникнуть в листья. Слейте излишки раствора инокулята с помощью листа бумаги и верните планы в соответствующую камеру роста. Через четыре дня после прививки срежьте либо надземную часть растения арабидопсиса, либо привитый лист с растения фасоли и поместите его в 20-миллилитровый шприц без иглы.Для листьев фасоли сверните лист на себя, оставив абаксиальную поверхность наружу. Добавьте достаточный объем дистиллированной воды, чтобы покрыть ткань. Затем вставьте поршень, удерживающий шприц в вертикальном положении, и удалите лишний воздух и пузырьки воздуха внутри шприца, осторожно постукивая по стволу, пока весь воздух не окажется возле наконечника, и, удалив воздух, накройте наконечник ствола шприца парафиновой пленкой.Теперь осторожно нажмите на поршень, чтобы создать положительное давление, пока ткань не потемнеет. Затем потяните за поршень, чтобы создать отрицательное давление. Удалите парафиновую пленку и поршень и соберите жидкость, содержащую бактерии, извлеченные из апопласта.Для одноклеточного анализа приготовьте 1,5%-ный раствор агарозы в дистиллированной воде. После расплавления добавьте достаточно объема, чтобы заполнить пространство между двумя предметными стеклами микроскопии, установленными рядом, и поместите сверху еще одно предметное стекло. Дайте им покататься в течение 15 минут и осторожно снимите горку, расположенную сверху.С помощью лезвия разрежьте агарозную подушечку на кусочки размером пять миллиметров на пять миллиметров перед использованием. Параллельно центрифугируйте один миллиметр бактерий, экстрагированных апопластом. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и суспендируйте гранулу в 20 микролитрах воды, чтобы сконцентрировать клетки.Поместите двухлитровую каплю концентрированных клеток на 0,17-миллиметровый покровный листок и накройте каплю кусочком агарозной подушечки. Визуализируйте бактериальный препарат под конфокальным микроскопом, чтобы идентифицировать зеленые флуоресцентные бактерии с помощью специальных лазеров. Определите все бактерии с помощью светлого поля и объедините оба поля.Чтобы выполнить анализ с помощью проточной цитометрии, возьмите аликвоту суспензий бактерий, экстрагированных апопластом. Проведите анализ с помощью проточного цитометра и получите 100 000 событий. Экспрессия hrpL GFP контролируется флуоресценцией GFP.На точечных графиках показано распределение интенсивности флуоресценции GFP в зависимости от размера клеток в популяции, а гистограммы показывают интенсивность флуоресценции GFP в зависимости от количества клеток. Процентное содержание hrpL ON было выше, чем соответствующее процентное соотношение hrpL OFF. Изображения флуоресцентной микроскопии показывают гетерогенные уровни GFP, связанные с экспрессией hrpL.Наблюдаются бактерии, демонстрирующие низкую флуоресценцию GFP или отсутствующую ее. Для достижения оптимальных результатов будьте осторожны на этапах экстракции бактерий, чтобы не повредить растительную ткань и, таким образом, ограничить загрязнение клеточным содержанием растений. Полученные образцы бактерий могут быть использованы для других целей, где снижение загрязнения растений является преимуществом, таких как экстракция нуклеиновых кислот для последующего бактериального геномного или транскриптомного анализа.

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Одноместный Электропорация сотовых в естественных условиях в течение Неповрежденный развивающийся мозг

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Робототехника и динамического анализа изображения для исследования экспрессии генов в тканях растений

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Анализ экспрессии млекопитающих Linker-гистонов подтипы

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Флуоресценции микроскопии Скрининг и следующего поколения секвенирования: Полезные инструменты для идентификации генов, вовлеченных в органелл Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Анализ глобальной РНК синтеза на уровне одной клетки следующем Гипоксия

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Визуализация пространственной реорганизацией МАРК сигнального пути с помощью переходного процесса система экспрессии Tobacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC Протокол Визуализирует экспрессии белка в одной резолюции клетки в тотальных препаратах кожи Маунт

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Визуальное стромул Частота с флуоресцентной микроскопией

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Рассечение Слуховые Буллы в постнатальном мышей: Выделение среднего уха Кости и гистологический анализ

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...