Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto RTI2018-095069-B-I00 financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ y por "ERDP A way of making Europe". J.S.R. fue financiado por el Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. fue financiado por la Subvención del Proyecto P18-RT-2398 del Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. Preparación de la planta
<ol><li>Prepare las plantas de Arabidopsis Col-0 siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Llene una maceta de 10 cm de diámetro con una mezcla de sustrato de planta de vermiculita 1:3 (consulte la Tabla de materiales), previamente regada, y cubra la maceta con una malla metálica de 15 cm x 15 cm con agujeros de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajuste la malla metálica al suelo húmedo con una banda elástica (Figura 1A).</li>
		<li>Con u...

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

El método presentado aquí describe un procedimiento no invasivo que permite la infiltración de bacterias en el tejido foliar de la planta, lo que permite la inoculación rápida de grandes volúmenes y minimiza la interrupción del tejido. Una de las características del complejo de especies de P. syringae es la capacidad de sobrevivir y proliferar dentro del apoplasto de la planta y en la superficie de la planta como epífita14. Por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de qu...

Las bacterias patógenas muestran diferencias en diversos fenotipos, dando lugar a la formación de subpoblaciones dentro de poblaciones genéticamente idénticas. Este fenómeno se conoce como heterogeneidad fenotípica y ha sido propuesto como una estrategia de adaptación durante las interacciones bacteriano-huésped1. Los avances recientes en la resolución óptica de microscopios confocales, citometría de flujo y microfluídica, combinados con proteínas fluorescentes, han fomentado el análisis unicelular de poblaciones bacterianas2.
La Pseudomonas syringae gramnegativa es una bacteria patógena vegetal arquetípica debido a su importancia académica y económica3. El ciclo de vida de P. syringae está ligado al ciclo del agua4. P. syringae entra en los espacios intercelulares entre las células mesófilas, el apoplasto de la hoja de la planta, a través de aberturas naturales como estomas o heridas5. Una vez dentro del apoplasto, P. syringae se basa en el sistema de secreción tipo III (T3SS) y los efectores translocados tipo III (T3E) para suprimir la inmunidad de la planta y manipular las funciones celulares de la planta en beneficio del patógeno6. La expresión de T3SS y T3E depende del regulador maestro HrpL, un factor sigma alternativo que se une a los motivos hrp-box en la región promotora de los genes diana7. 
Al generar fusiones transcripcionales localizadas en cromosomas a genes de proteínas fluorescentes aguas abajo del gen de interés, se puede monitorear la expresión génica en función de los niveles de fluorescencia emitidos a nivel de una sola célula8. Utilizando este método, se ha establecido que la expresión de hrpL es heterogénea tanto dentro de cultivos bacterianos cultivados en el laboratorio como dentro de poblaciones bacterianas recuperadas de la planta apoplast 8,9. Aunque el análisis de la expresión génica a nivel unicelular se realiza típicamente en cultivos bacterianos cultivados en medios de laboratorio, tales análisis también pueden llevarse a cabo en poblaciones bacterianas que crecen dentro de la planta, proporcionando así información valiosa sobre la formación de subpoblaciones en el contexto natural. Una limitación potencial para el análisis de poblaciones bacterianas extraídas de la planta es que los métodos clásicos de inoculación por infiltración de presión de jeringa en el apoplasto, seguidos de extracción bacteriana por maceración del tejido foliar, típicamente generan una gran cantidad de restos celulares de plantas que interfieren con el análisis aguas abajo10. La mayoría de los desechos celulares consisten en fragmentos autofluorescentes de cloroplastos que se superponen con la fluorescencia GFP, lo que resulta en resultados engañosos.
El presente protocolo describe el proceso de análisis de la heterogeneidad de la expresión génica unicelular en dos patosistemas modelo: el formado por P. syringae pv. cepa de tomate DC3000 y Arabidopsis thaliana (Col-0), y la otra por la P. syringae pv. phaseolicola cepa 1448A y plantas de frijol (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Se propone un método de inoculación basado en la infiltración al vacío utilizando una cámara de vacío y una bomba, lo que resulta en un método rápido y sin daños para infiltrar hojas enteras. Además, como mejora de los protocolos convencionales, se utiliza un método más suave para extraer la población bacteriana del apoplast que reduce significativamente la alteración tisular, basado en la extracción de líquido apoplástico mediante la aplicación de ciclos de presión positiva y negativa utilizando una pequeña cantidad de volumen dentro de una jeringa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

Una gran cantidad de microorganismos patógenos atacan constantemente a las plantas. El complejo de especies de Pseudomonas syringae engloba bacterias fitopatógenas gramnegativas de especial relevancia para un amplio número de hospedadores. P. syringae entra en la planta desde la superficie de la hoja y se multiplica rápidamente dentro del apoplasto, formando microcolonias que ocupan el espacio intercelular. La expresión constitutiva de proteínas fluorescentes por parte de las bacterias permite la visualización de las microcolonias y el seguimiento del desarrollo de la infección a nivel microscópico. Los avances recientes en el análisis de células individuales han revelado la gran complejidad alcanzada por las poblaciones bacterianas isogénicas clonales. Esta complejidad, conocida como heterogeneidad fenotípica, es la consecuencia de las diferencias de célula a célula en la expresión génica (no vinculadas a diferencias genéticas) entre la comunidad bacteriana. Para analizar la expresión de loci individuales a nivel de una sola célula, se han utilizado ampliamente fusiones transcripcionales a proteínas fluorescentes. Bajo condiciones de estrés, como las que ocurren durante la colonización del apoplasto de la planta, P. syringae se diferencia en distintas subpoblaciones basadas en la expresión heterogénea de genes clave de virulencia (es decir, el sistema de secreción Hrp tipo III). Sin embargo, el análisis unicelular de cualquier población dada de P. syringae recuperada del tejido vegetal es un desafío debido a los desechos celulares liberados durante la interrupción mecánica intrínseca a los procesos de inoculación y extracción bacteriana. En el presente informe se detalla un método elaborado para vigilar la expresión de los genes de P. syringae de interés a nivel unicelular durante la colonización de Arabidopsis y plantas de frijol. Se describe la preparación de las plantas y las suspensiones bacterianas utilizadas para la inoculación mediante una cámara de vacío. La recuperación de bacterias endófitas de hojas infectadas por extracción de fluido apoplástico también se explica aquí. Tanto la inoculación bacteriana como los métodos de extracción bacteriana están optimizados empíricamente para minimizar el daño de las células vegetales y bacterianas, lo que resulta en preparaciones bacterianas óptimas para el análisis de microscopía y citometría de flujo.

La expresión del sistema de secreción tipo III es esencial para el crecimiento bacteriano dentro de la planta. La expresión oportuna de los genes T3SS se logra a través de una regulación intrincada, en cuyo centro se encuentra el factor sigma HrpL de función extracitoplasmática (ECF), el activador clave de la expresión de genes relacionados con T3SS11. Previamente se realizó un análisis de la expresión de hrpL utilizando una fusión transcripcional localizada en cromosomas a un...

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Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

El presente protocolo describe un método que permite el análisis de expresión génica unicelular en poblaciones de Pseudomonas syringae cultivadas dentro del apoplasto vegetal.

Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae dentro del tejido vegetal

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Nuestro protocolo proporciona un método suave de inoculación y extracción de plantas que permite recuperar poblaciones bacterianas cultivadas en el apoplasto foliar adecuado para el análisis de expresión génica unicelular, como la citometría de flujo. Este método permite la extracción de una cantidad considerable de bacterias del apoplast sin contaminar significativamente las muestras con restos celulares vegetales. Este método optimizado para la recuperación de bacterias apoplásicas se puede aplicar directamente o con modificaciones menores a una serie de sistemas bacterianos de plantas que comprenden bacterias patógenas de plantas o bacterias endocíticas beneficiosas.Demostrando el procedimiento estará Nieves López-Pagán, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para comenzar, llene una maceta de 10 centímetros de diámetro con una mezcla de sustrato vegetal de vermiculita 1: 3 previamente regada. Cubra la maceta con una malla metálica perforada y ajuste la malla metálica al suelo húmedo con una banda elástica.A continuación, siembre semillas de Arabidopsis en los orificios de la malla metálica con un palillo de dientes húmedo. Coloque de tres a cuatro semillas en posiciones distantes dentro de la maceta. Cubra la olla con una cúpula de plástico para mantener alta humedad relativa e incube para la estratificación a cuatro grados centígrados durante 72 horas.Transfiera la maceta a una cámara de crecimiento de plantas en condiciones de días cortos. Para destapar la olla, retire la cúpula de plástico. Una vez germinadas las semillas, usa las pinzas para retirar la mayoría de las plántulas, manteniendo una plántula en cada una de las posiciones de la maceta.Luego prepare las plantas de frijol Phaseolus vulgaris cubriendo el fondo de una placa de Petri con un trozo de toalla de papel húmeda y colocando las semillas de frijol encima. Selle la placa de Petri con cinta quirúrgica e incube a 28 grados centígrados durante tres o cuatro días. Transfiera las semillas germinadas a una maceta de 10 centímetros de diámetro llena con una mezcla húmeda de sustrato vegetal de vermiculita 1: 3 e incube en una cámara de crecimiento de plantas en entornos de día largo.Extraiga el stock de glicerol de la cepa de siringas de Pseudomonas de interés de menos 80 grados centígrados en una placa LB suplementada con los antibióticos apropiados. Incubar la placa a 28 grados centígrados durante 40 a 48 horas. Raspa la biomasa bacteriana y resuspendela en cinco mililitros de cloruro de magnesio de 10 milimolares.Mida la densidad óptica a 600 nanómetros y ajústela a 0.1 agregando cloruro de magnesio de 10 milimolares. Realice diluciones seriadas en cloruro de magnesio 10 milimolares para obtener una concentración final de inóculo de cinco veces 10 a la quinta UFC por mililitro. Luego, prepare 200 mililitros de inóculo para las plantas de Arabidopsis y 50 mililitros para las plantas de frijol.Antes de la inoculación, añadir el tensioactivo Silwet L-77 a una concentración final de 0,02% para la inoculación de frijol y 0,01% para Arabidopsis. Para la infiltración de Arabidopsis, coloque dos palos de madera formando una X sobre la olla y coloque la olla boca abajo sobre una placa de Petri de 14 centímetros de diámetro que contiene 200 mililitros de inóculo. Para la inoculación de hojas de frijol, inserte las plantas y la solución de inóculo en una cámara de vacío e introduzca la hoja en un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros que contiene el inóculo.Dar un pulso de 500 milibares durante 30 segundos para infiltrarse en las hojas. Escurrir el exceso de solución de inóculo con un trozo de papel y devolver los planos a su cámara de crecimiento correspondiente. Cuatro días después de la inoculación, corte la parte aérea de la planta Arabidopsis o la hoja inoculada de la planta de frijol y colóquela en una jeringa de 20 mililitros sin aguja.Para las hojas de frijol, enrolle la hoja sobre sí misma, dejando la cara abaxial hacia afuera. Agregue suficiente volumen de agua destilada para cubrir el tejido. Luego, inserte el émbolo que sostiene la jeringa en posición vertical y retire el exceso de aire y las burbujas de aire dentro de la jeringa golpeando suavemente el barril hasta que todo el aire esté ubicado cerca de la punta y, después de retirar el aire, cubra la punta del cilindro de la jeringa con una película de parafina.Ahora presione cuidadosamente el émbolo para generar presión positiva hasta que el tejido se oscurezca. Luego, tire del émbolo para generar presión negativa. Retire la película de parafina y el émbolo y recoja el líquido que contiene las bacterias extraídas por el apoplasto.Para un análisis de una sola célula, prepare una solución de agarosa al 1,5% en agua destilada. Una vez fundido, agregue suficiente volumen para llenar el espacio entre dos portaobjetos de microscopía colocados uno al lado del otro y coloque otro portaobjetos encima. Déjelos conducir durante 15 minutos y retire el tobogán colocado en la parte superior con cuidado.Con una cuchilla, corte la almohadilla de agarosa en trozos de cinco milímetros por cinco milímetros antes de usarlos. Paralelamente, centrifugar un milímetro de las bacterias extraídas por el apoplasto. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet en 20 microlitros de agua para concentrar las células.Coloque una gota de dos microlitros de las células concentradas en un cubreobjetos de 0,17 milímetros y cubra la gota con un trozo de almohadilla de agarosa. Visualice la preparación bacteriana bajo el microscopio confocal para identificar bacterias fluorescentes verdes utilizando láseres específicos. Identifique todas las bacterias usando el campo brillante y combine ambos campos.Para realizar el análisis por citometría de flujo, tome una alícuota de las suspensiones de bacterias extraídas con apoplastos. Analice usando el citómetro de flujo y adquiera 100, 000 eventos. La expresión de hrpL GFP es monitoreada por fluorescencia GFP.Los gráficos de diagramas de puntos muestran la distribución de la intensidad de fluorescencia de GFP versus el tamaño celular en la población, mientras que los histogramas muestran la intensidad de fluorescencia de GFP versus recuentos celulares. Los porcentajes de hrpL ON fueron más altos que los porcentajes correspondientes de hrpL OFF. Las imágenes de microscopía de fluorescencia muestran niveles heterogéneos de GFP asociados con la expresión de hrpL.Se observan bacterias que muestran baja o ninguna fluorescencia GFP. Para obtener resultados óptimos, sea suave durante los pasos de extracción de bacterias para evitar dañar el tejido vegetal y así limitar la contaminación del contenido celular de la planta. Las muestras de bacterias obtenidas se pueden utilizar para otros fines en los que la reducción de la contaminación de las plantas es una ventaja, como las extracciones de ácidos nucleicos para su posterior análisis genómico o transcriptómico bacteriano.

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

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