Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Detta arbete stöddes av projektbidrag RTI2018-095069-B-I00 finansierat av MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ och av "ERDP: Ett sätt att skapa Europa". JSR finansierades av Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. finansierades av Project Grant P18-RT-2398 från Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. Beredning av växter
<ol><li>Förbered Arabidopsis Col-0-växter enligt stegen nedan.<ol><li>Fyll en kruka med en diameter på 10 cm med en 1: 3 vermikulit-växtsubstratblandning (se materialtabell), tidigare vattnad, och täck krukan med ett 15 cm x 15 cm metallnät med 1,6 mm x 1,6 mm hål. Justera metallnätet till den våta jorden med ett gummiband (figur 1A).</li>
		<li>Så Arabidopsisfrön med en våt tandpetare i hålen i metallnätet. Placera tr...

<ol>
	<li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity:+A+bacterial+virulence+strategy.">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li><li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters.">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle.">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic,+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains.">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li><li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors:+Beyond+suppression+of+immunity.">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li><li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae.">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae.">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li><li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host.">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).</li><li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor.">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li><li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robust Statistics. , (1981).</li><li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae:+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization.">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem.">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).</li><li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).</li><li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

Metoden som presenteras här beskriver ett icke-invasivt förfarande som möjliggör infiltration av bakterier i växtbladvävnaden, vilket möjliggör snabb inokulering av stora volymer samtidigt som vävnadsstörningar minimeras. En av egenskaperna hos P. syringae-artkomplexet är förmågan att överleva och sprida sig inuti växtapoplasten och på växtytan som epifyt14. Således kan möjligheten att bakterierna extraherade med hjälp av detta protokoll endast kommer från växtapopla...

Patogena bakterier uppvisar skillnader i olika fenotyper, vilket ger upphov till bildandet av subpopulationer inom genetiskt identiska populationer. Detta fenomen är känt som fenotypisk heterogenitet och har föreslagits som en anpassningsstrategi under bakterie-värdinteraktioner1. Nya framsteg inom optisk upplösning av konfokalmikroskop, flödescytometri och mikrofluidik, i kombination med fluorescerande proteiner, har främjat encellsanalyser av bakteriepopulationer2.
Den gramnegativa Pseudomonas syringae är en arketypisk växtpatogen bakterie på grund av både dess akademiska och ekonomiska betydelse3. Livscykeln för P. syringae är kopplad till vattnets kretslopp4. P. syringae kommer in i de intercellulära utrymmena mellan mesofyllcellerna, växtbladets apoplast, genom naturliga öppningar som stomata eller sår5. En gång inom apoplasten förlitar sig P. syringae på typ III-sekretionssystemet (T3SS) och typ III-translokerade effektorer (T3E) för att undertrycka växtimmunitet och manipulera växtcellulära funktioner till förmån för patogenen6. Uttrycket av T3SS och T3E beror på masterregulatorn HrpL, en alternativ sigmafaktor som binder till hrp-boxmotiven i promotorregionen för målgenerna7. 
Genom att generera kromosomlokaliserade transkriptionsfusioner till fluorescerande proteingener nedströms genen av intresse kan man övervaka genuttryck baserat på fluorescensnivåerna som emitteras på encellsnivå8. Med hjälp av denna metod har det fastställts att uttrycket av hrpL är heterogent både inom bakteriekulturer odlade i laboratoriet och inom bakteriepopulationer som återvunnits från växtapoplasten 8,9. Även om genuttrycksanalys på encellsnivå vanligtvis utförs i bakteriekulturer som odlas i laboratoriemedia, kan sådana analyser också utföras på bakteriepopulationer som växer inom växten, vilket ger värdefull information om bildandet av subpopulationer i det naturliga sammanhanget. En potentiell begränsning för analys av bakteriepopulationer extraherade från växten är att klassiska inokuleringsmetoder genom spruttryckinfiltration i apoplasten, följt av bakteriell extraktion genom maceration av bladvävnaden, vanligtvis genererar en stor mängd cellulärt växtskräp som stör nedströmsanalys10. De flesta cellulära skräp består av autofluorescerande fragment av kloroplaster som överlappar GFP-fluorescens, vilket resulterar i vilseledande resultat.
Detta protokoll beskriver processen för att analysera encellsgenuttryckets heterogenitet i två modellpatosystem: det som bildas av P. syringae pv. tomatstam DC3000 och Arabidopsis thaliana (Col-0), och den andra av P. syringae pv. phaseolicola stam 1448A och bönplantor (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). En inokuleringsmetod föreslås baserad på vakuuminfiltration med hjälp av en vakuumkammare och en pump, vilket resulterar i en snabb och skadefri metod för att infiltrera hela blad. Dessutom, som en förbättring av konventionella protokoll, används en mildare metod för att extrahera bakteriepopulationen från apoplasten som signifikant minskar vävnadsstörningar, baserat på extraktion av apoplastvätska genom att applicera cykler av positivt och negativt tryck med en liten mängd volym i en spruta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

En uppsjö av patogena mikroorganismer attackerar ständigt växter. Artkomplexet Pseudomonas syringae omfattar gramnegativa växtpatogena bakterier av särskild relevans för ett stort antal värdar. P. syringae kommer in i växten från bladytan och multiplicerar snabbt inom apoplasten och bildar mikrokolonier som upptar det intercellulära utrymmet. Det konstitutiva uttrycket av fluorescerande proteiner av bakterierna möjliggör visualisering av mikrokolonierna och övervakning av infektionens utveckling på mikroskopisk nivå. Nya framsteg inom encellsanalys har avslöjat den stora komplexitet som uppnås av klonala isogena bakteriepopulationer. Denna komplexitet, kallad fenotypisk heterogenitet, är konsekvensen av cell-till-cell-skillnader i genuttryck (inte kopplat till genetiska skillnader) bland bakteriesamhället. För att analysera uttrycket av enskilda loci på encellsnivå har transkriptionella fusioner till fluorescerande proteiner använts i stor utsträckning. Under stressförhållanden, såsom de som inträffar under kolonisering av växtapoplasten, differentierar P. syringae i distinkta subpopulationer baserat på det heterogena uttrycket av viktiga virulensgener (dvs Hrp typ III-sekretionssystemet). Emellertid, encellsanalys av en given P. syringae-population som återhämtats från växtvävnad är utmanande på grund av det cellulära skräpet som frigörs under den mekaniska störningen som är inneboende i inokulerings- och bakterieextraktionsprocesserna. Denna rapport beskriver en metod som utvecklats för att övervaka uttrycket av P. syringae-gener av intresse på encellsnivå under koloniseringen av Arabidopsis och bönplantor. Beredningen av växterna och de bakteriesuspensioner som används för inokulering med användning av en vakuumkammare beskrivs. Återhämtningen av endofytiska bakterier från infekterade löv genom apoplastisk vätskeextraktion förklaras också här. Både bakterieinokulerings- och bakterieextraktionsmetoderna är empiriskt optimerade för att minimera växt- och bakteriecellskador, vilket resulterar i bakteriepreparat optimala för mikroskopi och flödescytometrianalys.

Uttrycket av typ III-sekretionssystemet är avgörande för bakterietillväxt inom växten. Det tidiga uttrycket av T3SS-gener uppnås genom invecklad reglering, i mitten av vilken är den extracytoplasmatiska funktionen (ECF) sigmafaktor HrpL, nyckelaktivatorn för uttrycket av T3SS-relaterade gener11. En analys av uttrycket av hrpL utfördes tidigare med hjälp av en kromosomlokaliserad transkriptionell fusion till en nedströms promotorlös gfp-gen och genom att följa uttryck...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Detta protokoll beskriver en metod som möjliggör encellsanalys av genuttryck på Pseudomonas syringae-populationer odlade inom växtapoplasten.

Encellsanalys av uttrycket av Pseudomonas syringae-gener i växtvävnaden

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Vårt protokoll tillhandahåller en mild växtinokulerings- och extraktionsmetod som möjliggör återhämtning av bakteriepopulationer odlade i bladapoplasten som är lämpliga för encellsgenuttrycksanalys, såsom flödescytometri. Denna metod möjliggör extraktion av en betydande mängd bakterier från apoplasten utan att väsentligt förorena proverna med växtcellulära skräp. Denna optimerade metod för återhämtning av apoplastiska bakterier kan tillämpas direkt eller med mindre modifieringar på ett antal växtbakteriesystem som omfattar antingen växtpatogena bakterier eller fördelaktiga endocytiska bakterier.Demonstrerar proceduren kommer att vara Nieves Lopez-Pagan, en doktorand från vårt laboratorium. För att börja fylla en kruka med en diameter på 10 centimeter med tidigare vattnad 1: 3 vermikulitväxtsubstratblandning. Täck krukan med ett perforerat metallnät och justera metallnätet till våtmarken med ett gummiband.Så så Arabidopsis frön i hålen i metallnätet med en våt tandpetare. Placera tre till fyra frön i avlägsna positioner i potten. Täck krukan med en plastkupol för att bibehålla hög relativ luftfuktighet och inkubera för stratifiering vid fyra grader Celsius i 72 timmar.Överför potten till en växttillväxtkammare under korta dagsförhållanden. För att avslöja potten, ta bort plastkupolen. När fröna har groddar, använd pincetten för att ta bort de flesta plantorna och håll en planta i var och en av krukans positioner.Förbered sedan Phaseolus vulgaris bönplantor genom att täcka botten av en petriskål med en våt bit pappershandduk och placera bönfrön ovanpå den. Försegla petriskålen med kirurgisk tejp och inkubera vid 28 grader Celsius i tre till fyra dagar. Överför de grodda fröna till en kruka med en diameter på 10 centimeter fylld med vått 1: 3 vermikulitväxtsubstrat, blanda och inkubera i en växttillväxtkammare under långa dagsinställningar.Stryk ut glycerolstammen av Pseudomonas syringae-stam av intresse från minus 80 grader Celsius till en LB-platta kompletterad med lämpliga antibiotika. Inkubera plattan vid 28 grader Celsius i 40 till 48 timmar. Skrapa bakteriebiomassan och resuspendera den i fem milliliter 10 millimolär magnesiumklorid.Mät den optiska densiteten vid 600 nanometer och justera den till 0,1 genom att tillsätta 10 millimolar magnesiumklorid. Utför serieutspädningar i 10-millimolär magnesiumklorid för att få en slutlig inokulumkoncentration på fem gånger 10 till femte CFU per milliliter. Förbered sedan 200 ml inokulum för Arabidopsis-växterna och 50 ml för bönplantorna.Före ympning, tillsätt tensiden Silwet L-77 till en slutlig koncentration på 0,02% för böninokulering och 0,01% för Arabidopsis. För Arabidopsis-infiltration, placera två träpinnar som bildar ett X över potten och placera krukan nedåt över en petriskål med en diameter på 14 centimeter som innehåller 200 ml inokulum. För ympning av bönablad, sätt in växterna och inokulumlösningen i en vakuumkammare och för in bladet i ett 50 ml koniskt centrifugrör innehållande inokulatet.Ge en puls på 500 millibar i 30 sekunder för att infiltrera bladen. Töm överflödig inokulumlösning med ett papper och returnera planerna till motsvarande tillväxtkammare. Fyra dagar efter ympning, skär antingen antenndelen av Arabidopsis-växten eller det inokulerade bladet från bönplantan och placera det i en 20-ml spruta utan nål.För bönablad, rulla bladet på sig själv och lämna det abaxiella ansiktet utåt. Tillsätt tillräckligt med destillerat vatten för att täcka vävnaden. Sätt sedan in kolven som håller sprutan i upprätt läge och avlägsna överflödig luft och luftbubblor inuti sprutan genom att försiktigt knacka på cylindern tills all luft ligger nära spetsen och, efter att ha tagit bort luften, täck spetsen på sprutcylindern med paraffinfilm.Tryck nu försiktigt på kolven för att generera övertryck tills vävnaden blir mörkare. Dra sedan i kolven för att generera undertryck. Ta bort paraffinfilmen och kolven och samla upp vätskan som innehåller de apoplastextraherade bakterierna.För en encellsanalys, förbered en 1,5% agaroslösning i destillerat vatten. När du har smält, lägg till tillräckligt med volym för att fylla utrymmet mellan två mikroskopiglas som ligger sida vid sida och placera en annan bild ovanpå. Låt dem köra i 15 minuter och ta bort bilden som placerats på toppen försiktigt.Skär agarosdynan i fem millimeter med fem millimeter bitar före användning med ett blad. Parallellt centrifugerar en millimeter av de apoplastextraherade bakterierna. Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett och återsuspendera pelleten i 20 mikroliter vatten för att koncentrera cellerna.Placera en två mikroliter droppe av de koncentrerade cellerna på en 0,17 millimeter täckslip och täck droppen med en bit agaroskudde. Visualisera bakteriepreparatet under konfokalmikroskopet för att identifiera gröna fluorescerande bakterier med hjälp av specifika lasrar. Identifiera alla bakterier med hjälp av ljusfältet och slå samman båda fälten.För att utföra analys med flödescytometri, ta en alikvot av de apoplastextraherade bakteriesuspensionerna. Analysera med hjälp av flödescytometern och förvärva 100 000 händelser. Uttryck av hrpL GFP övervakas med GFP-fluorescens.Punktdiagrammen visar fluorescensintensitetsfördelningen av GFP kontra cellstorlek i befolkningen, medan histogrammen visar fluorescensintensiteten för GFP kontra cellantal. Procentsatserna för hrpL ON var högre än motsvarande procentandelar av hrpL OFF. Fluorescensmikroskopibilder visar heterogena nivåer av GFP associerade med uttrycket av hrpL.Bakterier som uppvisar låg eller ingen GFP-fluorescens observeras. För optimala resultat, var försiktig under bakterieextraktionsstegen för att undvika att skada växtvävnaden och därmed begränsa kontaminering från växtcellinnehållet. De erhållna bakterieproverna kan användas för andra ändamål där reducering av växtföroreningar är en fördel, såsom nukleinsyraextraktioner för efterföljande bakteriell genomisk eller transkriptomisk analys.

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single Cell elektroporation in vivo i den intakta växande hjärnan

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robotics och Dynamic bildanalys för studier av genuttryck i plantvävnader

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Expression Analys av däggdjur Linker-histon Subtyper

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening och nästa generations sekvensering: Användbara verktyg för identifiering av gener involverade i Organell Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Avbildning Rumslig Reorganisation av ett MAPK-signalvägen Använda Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC protokoll Visualiserar proteinuttryck på Single Cell Beslut hela montera hudpreparat

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule frekvens med fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Dissektion av Auditory Bulla i Postnatal Möss: Isolering av mellanörat Skelett och histologisk analys

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...