Name: single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Bu çalışma, MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ tarafından finanse edilen RTI2018-095069-B-I00 Projesi Hibesi ve "ERDP: Avrupa'yı Yapmanın Bir Yolu" tarafından desteklenmiştir. J.S.R., Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020) tarafından finanse edildi. N.L.P., Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación'dan Project Grant P18-RT-2398 tarafından finanse edildi.

1. Bitki hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek Arabidopsis Col-0 tesislerini hazırlayın.<ol><li>10 cm çapında bir tencereyi, daha önce sulanmış 1:3 vermikülit-bitki substrat karışımı ile doldurun (bkz. Malzeme Tablosuna bakınız) ve tencereyi 1,6 mm x 1,6 mm deliklere sahip 15 cm x 15 cm metal bir ağ ile örtün. Metal ağı bir lastik bant kullanarak ıslak toprağa ayarlayın (Şekil 1A).</li>
		<li>Islak bir kürdanla, Arabi...

<ol>
	<li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity:+A+bacterial+virulence+strategy.">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li><li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters.">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).</li><li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology.">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li><li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle.">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic,+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains.">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li><li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors:+Beyond+suppression+of+immunity.">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li><li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae.">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li><li>Rufi&#225;n, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae.">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li><li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host.">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li><li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction.">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).</li><li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor.">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li><li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Robust Statistics. , (1981).</li><li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise.">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).</li><li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen,+ice+nucleus,+and+epiphyte.">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li><li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae:+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization.">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem.">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).</li><li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).</li><li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana.">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li></ol>

Burada sunulan yöntem, bakterilerin bitki yaprak dokusuna sızmasına izin veren, doku bozulmasını en aza indirirken büyük hacimlerin hızlı bir şekilde aşılanmasına izin veren invaziv olmayan bir prosedürü açıklamaktadır. P. syringae tür kompleksinin özelliklerinden biri, bitki apoplastının içinde ve bitki yüzeyinde epifit14 olarak hayatta kalma ve çoğalma yeteneğidir. Bu nedenle, mevcut protokol kullanılarak ekstrakte edilen bakterilerin sadece bitki apoplastın...

Patojenik bakteriler, çeşitli fenotiplerde farklılıklar göstererek, genetik olarak özdeş popülasyonlarda alt popülasyonların oluşumuna yol açar. Bu fenomen fenotipik heterojenite olarak bilinir ve bakteriyel-konakçı etkileşimleri sırasında bir adaptasyon stratejisi olarak önerilmiştir1. Konfokal mikroskopların, akış sitometrisinin ve mikroakışkanların optik çözünürlüğündeki son gelişmeler, floresan proteinlerle birleştiğinde, bakteri popülasyonlarının tek hücreli analizlerini teşvik etmiştir2.
Gram-negatif Pseudomonas şırıngası, hem akademik hem de ekonomik önemi nedeniyle arketipik bir bitki patojenik bakterisidir3. P. syringae'nin yaşam döngüsüsu döngüsü 4 ile bağlantılıdır. P. syringae, mezofil hücreleri, bitki yaprağı apoplastı arasındaki hücreler arası boşluklara, stoma veya yaralar gibi doğal açıklıklardan girer5. Apoplastın içine girdikten sonra, P. syringae, bitki bağışıklığını baskılamak ve patojen6'nın yararına bitki hücresel fonksiyonlarını manipüle etmek için tip III sekresyon sistemine (T3SS) ve tip III-translokasyonlu efektörlere (T3E) güvenir. T3SS ve T3E'nin ekspresyonu, hedef genlerinpromotör bölgesindeki hrp-box motiflerine bağlanan alternatif bir sigma faktörü olan ana düzenleyici HrpL'ye bağlıdır 7.
İlgili genin aşağı yönündeki floresan protein genlerine kromozom yerleşimli transkripsiyonel füzyonlar üreterek, tek hücreli seviye8'de yayılan floresan seviyelerine dayanarak gen ekspresyonunu izleyebiliriz. Bu yöntem kullanılarak, hrpL ekspresyonunun hem laboratuvarda yetiştirilen bakteri kültürlerinde hem de apoplast 8,9 bitkisinden elde edilen bakteri popülasyonlarında heterojen olduğu tespit edilmiştir. Tek hücreli düzeyde gen ekspresyon analizi tipik olarak laboratuvar ortamında yetiştirilen bakteri kültürlerinde yapılmasına rağmen, bu tür analizler bitki içinde büyüyen bakteri popülasyonları üzerinde de gerçekleştirilebilir, böylece doğal bağlamda alt popülasyonların oluşumu hakkında değerli bilgiler sağlanır. Bitkiden ekstrakte edilen bakteri popülasyonlarının analizi için potansiyel bir sınırlama, apoplasta şırınga basıncı infiltrasyonu ile klasik aşılama yöntemlerinin, ardından yaprak dokusunun maserasyonu ile bakteriyel ekstraksiyonun tipik olarak aşağı akış analizine müdahale eden büyük miktarda hücresel bitki kalıntısı oluşturmasıdır10. Çoğu hücresel enkaz, GFP floresansı ile örtüşen ve yanıltıcı sonuçlara neden olan otofloresan kloroplast parçalarından oluşur.
Mevcut protokol, iki model patosistemde tek hücreli gen ekspresyon heterojenitesini analiz etme sürecini açıklamaktadır: P. syringae pv tarafından oluşturulan. domates suşu DC3000 ve Arabidopsis thaliana (Col-0), diğeri ise P. syringae pv. phaseolicola suşu 1448A ve fasulye bitkileri (Phaseolus vulgaris çeşidi Kanada Harikası). Bir vakum odası ve bir pompa kullanılarak vakum infiltrasyonuna dayanan bir aşılama yöntemi önerilmiştir, bu da tüm yapraklara sızmak için hızlı ve hasarsız bir yöntemle sonuçlanır. Ayrıca, geleneksel protokollerde bir gelişme olarak, bakteri popülasyonunu apoplasttan çıkarmak için, bir şırınga içinde az miktarda hacim kullanarak pozitif ve negatif basınç döngüleri uygulayarak apoplastik sıvının ekstraksiyonuna dayanarak, doku bozulmasını önemli ölçüde azaltan daha yumuşak bir yöntem kullanılır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 x 1.6 mm metal mesh</td>
			<td>Buzifu</td>
			<td></td>
			<td>Fiberglass screen mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm diameter pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 mm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Roko</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Stellaris</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSVerse cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G-0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>K378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Cromton Europe Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber 25 cm diameter</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>GAST</td>
			<td>DOA-P504-BN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No special requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Merk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of the expression of pseudomonas syringae genes within the plant tissue

Patojenik mikroorganizmaların bolluğu sürekli olarak bitkilere saldırır. Pseudomonas syringae tür kompleksi, çok sayıda konakçı için özel öneme sahip Gram-negatif bitki-patojenik bakterileri kapsar. P. syringae bitkiye yaprak yüzeyinden girer ve apoplast içinde hızla çoğalarak hücreler arası boşluğu işgal eden mikrokoloniler oluşturur. Floresan proteinlerin bakteriler tarafından yapısal ekspresyonu, mikrokolonilerin görselleştirilmesine ve enfeksiyonun gelişiminin mikroskobik düzeyde izlenmesine izin verir. Tek hücreli analizdeki son gelişmeler, klonal izojenik bakteri popülasyonlarının ulaştığı büyük karmaşıklığı ortaya koymuştur. Fenotipik heterojenite olarak adlandırılan bu karmaşıklık, bakteri topluluğu arasındaki gen ekspresyonundaki (genetik farklılıklarla bağlantılı olmayan) hücreden hücreye farklılıkların sonucudur. Tek hücreli düzeyde bireysel lokusların ekspresyonunu analiz etmek için, floresan proteinlere transkripsiyonel füzyonlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Bitki apoplastının kolonizasyonu sırasında meydana gelenler gibi stres koşulları altında, P. syringae , anahtar virülans genlerinin heterojen ekspresyonuna (yani, Hrp tip III sekresyon sistemi) dayanarak farklı alt popülasyonlara ayrılır. Bununla birlikte, bitki dokusundan geri kazanılan herhangi bir P. şırınga popülasyonunun tek hücreli analizi, aşılama ve bakteriyel ekstraksiyon işlemlerine özgü mekanik bozulma sırasında salınan hücresel enkaz nedeniyle zordur. Bu rapor, Arabidopsis ve fasulye bitkilerinin kolonizasyonu sırasında ilgilenilen P. syringae genlerinin ekspresyonunu tek hücre düzeyinde izlemek için geliştirilen bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bitkilerin hazırlanması ve bir vakum odası kullanılarak aşılama için kullanılan bakteriyel süspansiyonlar açıklanmaktadır. Endofitik bakterilerin apoplastik sıvı ekstraksiyonu ile enfekte olmuş yapraklardan geri kazanımı da burada açıklanmaktadır. Hem bakteriyel aşılama hem de bakteriyel ekstraksiyon yöntemleri, bitki ve bakteri hücresi hasarını en aza indirmek için ampirik olarak optimize edilmiştir, bu da mikroskopi ve akış sitometri analizi için en uygun bakteriyel preparatlarla sonuçlanır.

Tip III sekresyon sisteminin ekspresyonu, bitki içindeki bakteri büyümesi için gereklidir. T3SS genlerinin zamanında ekspresyonu, merkezinde T3SS ile ilişkili genlerin ekspresyonunun anahtar aktivatörü olan ekstrasitoplazmik fonksiyon (ECF) sigma faktörü HrpL olan karmaşık düzenleme yoluyla elde edilir11. HRPL ekspresyonunun bir analizi daha önce aşağı akış promotersiz gfp genine kromozom yerleşimli bir transkripsiyonel füzyon kullanılarak ve konfokal mikros...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue at JoVE.com

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Bu protokol, bitki apoplastı içinde yetiştirilen Pseudomonas şırıngası popülasyonları üzerinde tek hücreli gen ekspresyon analizine izin veren bir yöntemi açıklamaktadır.

Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Protokolümüz, yaprak apoplastında yetişen bakteri popülasyonlarının geri kazanılmasını sağlayan nazik bir bitki aşılama ve ekstraksiyon yöntemi sağlar, bu da akış sitometrisi gibi tek hücreli gen ekspresyon analizi için uygundur. Bu yöntem, numuneleri bitki hücresel kalıntıları ile önemli ölçüde kirletmeden apoplasttan önemli miktarda bakterinin ekstraksiyonuna izin verir. Apoplastik bakterilerin geri kazanımı için optimize edilmiş bu yöntem, bitki patojenik bakterileri veya faydalı endositik bakterileri içeren bir dizi bitki bakteri sistemine doğrudan veya küçük değişikliklerle uygulanabilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Nieves Lopez-Pagan olacaktır. Başlamak için, 10 santimetre çapında bir tencereyi önceden sulanmış 1:3 vermikülit bitki substratı karışımı ile doldurun. Tencereyi delikli bir metal ağ ile örtün ve metal ağı lastik bir bant kullanarak ıslak toprağa ayarlayın.Daha sonra, Arabidopsis tohumlarını ıslak bir kürdan ile metal ağın deliklerine ekin. Üç ila dört tohumu tencerenin içinde uzak pozisyonlara yerleştirin. Yüksek bağıl nemi korumak için tencereyi plastik bir kubbe ile örtün ve 72 saat boyunca dört santigrat derecede tabakalaşma için inkübe edin.Saksıyı kısa gün koşullarında bir bitki büyüme odasına aktarın. Tencereyi ortaya çıkarmak için plastik kubbeyi çıkarın. Tohumlar çimlendikten sonra, fidelerin çoğunu çıkarmak için cımbız kullanın, saksının her birinde bir fide tutun.Daha sonra bir Petri kabının altını ıslak bir kağıt havluyla kaplayarak ve fasulye tohumlarını üstüne yerleştirerek Phaseolus vulgaris fasulye bitkilerini hazırlayın. Petri kabını cerrahi bantla kapatın ve üç ila dört gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Çimlenmiş tohumları ıslak 1: 3 vermikülit bitki substratı karışımı ile doldurulmuş 10 santimetre çapında bir tencereye aktarın ve uzun gün ayarları altında bir bitki büyüme odasında inkübe edin.İlgilenilen Pseudomonas şırıngasının gliserol stoğunu eksi 80 santigrat dereceden uygun antibiyotiklerle desteklenmiş bir LB plakasına çizin. Plakayı 40 ila 48 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Bakteriyel biyokütleyi kazıyın ve beş mililitre 10 milimolar magnezyum klorür içinde yeniden askıya alın.Optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün ve 10 milimolar magnezyum klorür ekleyerek 0.1'e ayarlayın. Mililitre başına beş kez 10 ila beşinci CFU'luk nihai bir inokülum konsantrasyonu elde etmek için 10 milimolar magnezyum klorürde seri seyreltmeler yapın. Daha sonra, Arabidopsis bitkileri için 200 mililitre inokülum ve fasulye bitkileri için 50 mililitre hazırlayın.Aşılamadan önce, yüzey aktif madde Silwet L-77'yi fasulye aşılaması için% 0.02 ve Arabidopsis için% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Arabidopsis infiltrasyonu için, tencerenin üzerine bir X oluşturan iki tahta çubuk yerleştirin ve tencereyi 200 mililitre inokülum içeren 14 santimetre çapında bir Petri kabının üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Fasulye yapraklarının aşılanması için, bitkileri ve inokulum çözeltisini bir vakum odasına yerleştirin ve yaprağı, inokulumu içeren 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.Yapraklara sızmak için 30 saniye boyunca 500 milibar nabız verin. Fazla inokülum çözeltisini bir parça kağıtla boşaltın ve planları karşılık gelen büyüme odalarına geri gönderin. Aşılamadan dört gün sonra, Arabidopsis bitkisinin hava kısmını veya aşılanmış yaprağı fasulye bitkisinden kesin ve iğnesiz 20 mililitrelik bir şırıngaya yerleştirin.Fasulye yaprakları için, yaprağı kendi üzerine yuvarlayın ve abaksiyel yüzü dışa doğru bırakın. Dokuyu örtmek için yeterli miktarda damıtılmış su ekleyin. Daha sonra, şırıngayı dik konumda tutan pistonu yerleştirin ve tüm hava ucun yanına yerleşene kadar namluya hafifçe dokunarak şırınganın içindeki fazla hava ve hava kabarcıklarını çıkarın ve havayı çıkardıktan sonra şırınga namlusunun ucunu parafin filmi ile örtün.Şimdi doku koyulaşana kadar pozitif basınç oluşturmak için pistona dikkatlice bastırın. Ardından, negatif basınç oluşturmak için pistonu çekin. Parafin filmi ve pistonu çıkarın ve apoplastla ekstrakte edilen bakterileri içeren sıvıyı toplayın.Tek hücreli bir analiz için, damıtılmış suda% 1.5'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Eritildikten sonra, yan yana yerleştirilmiş iki mikroskopi slaytı arasındaki boşluğu doldurmak için yeterli hacim ekleyin ve üstüne başka bir slayt yerleştirin. 15 dakika sürmelerine izin verin ve üstüne yerleştirilen slaytı dikkatlice çıkarın.Bir bıçak kullanarak, agaroz pedini kullanmadan önce beş milimetre beş milimetre parçaya bölün. Paralel olarak, apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin bir milimetresini santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri konsantre etmek için peleti 20 mikrolitre suya yeniden askıya alın.Konsantre hücrelerin iki mikrolitrelik bir damlasını 0.17 milimetrelik bir kapak kayması üzerine yerleştirin ve damlayı bir parça agaroz pedi ile örtün. Belirli lazerler kullanarak yeşil floresan bakterileri tanımlamak için bakteri preparatını konfokal mikroskop altında görselleştirin. Parlak alanı kullanarak tüm bakterileri tanımlayın ve her iki alanı birleştirin.Akış sitometrisi ile analiz yapmak için, apoplastla ekstrakte edilen bakteri süspansiyonlarının bir alikotunu alın. Akış sitometresini kullanarak analiz edin ve 100.000 olay elde edin. HRPL GFP ekspresyonu GFP floresan ile izlenir.Nokta grafiği grafikleri, GFP'nin popülasyondaki hücre boyutuna karşı floresan yoğunluğu dağılımını gösterirken, histogramlar GFP'nin hücre sayılarına karşı floresan yoğunluğunu gösterir. Floresan mikroskopi görüntüleri, hrpL OFF ekspresyonu ile ilişkili heterojen GFP seviyelerini göstermektedir.GFP floresansı düşük olan veya hiç olmayan bakteriler gözlenir. En iyi sonuçlar için, bitki dokusuna zarar vermemek ve böylece bitki hücresel içeriğinden kaynaklanan kontaminasyonu sınırlamak için bakteri ekstraksiyon adımları sırasında nazik olun. Elde edilen bakteri örnekleri, bitki kontaminasyonunu azaltmanın, sonraki bakteriyel genomik veya transkriptomik analiz için nükleik asit ekstraksiyonları gibi bir avantaj olduğu diğer amaçlar için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Doğum sonrası Farelerde İşitsel Bulla diseksiyonu: Orta Kulak Kemikler ve histolojik analiz izolasyonu

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...