Name: evaluation of the efficacy of organic peroxyacids for eradicating dairy biofilms using an approach combining static and dynamic methods
Uploaded: 2022-12-09T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc e pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RDCPJ516460-17). Agradecemos a Teresa Paniconi pela revisão crítica do manuscrito.

O trabalho contido neste artigo requer um laboratório de nível 2 de biossegurança e foi previamente aprovado (Projeto número 119689) pelo comitê institucional de biossegurança da Université Laval.
NOTA: O fluxograma da Figura 1 representa um resumo da metodologia que combina abordagens estáticas e dinâmicas que foi utilizada para avaliar a eficácia dos peroxiácidos orgânicos na erradicação de biofilmes.
1. Preparaç?...

<ol>
	<li>Canada's dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre Available from: <a target="_blank" href="https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance">https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance</a> (2017)</li><li>Oliver, S. P., Jayarao, B. M., Almeida, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foodborne+pathogens+in+milk+and+the+dairy+farm+environment:+food+safety+and+public+health+implications.">Foodborne pathogens in milk and the dairy farm environment: food safety and public health implications.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 2 (2), 115-129 (2005).</li><li>Fondation de technologie laiti&#232;re du Qu&#233;bec. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science et technologie du lait. 3rd edn. , (2018).</li><li>Evanowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+communication:+Pseudomonas+azotoformans+causes+gray+discoloration+in+HTST+fluid+milk.">Short communication: Pseudomonas azotoformans causes gray discoloration in HTST fluid milk.</a> Journal of dairy science. 100, 7906-7909 (2017).</li><li>Bower, C. K., McGuire, J., Daeschel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+and+detachment+of+bacteria+and+spores+on+food-contact+surfaces.">The adhesion and detachment of bacteria and spores on food-contact surfaces.</a> Trends in Food Science &amp; Technology. 7 (5), 152-157 (1996).</li><li>Gupta, S., Anand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pitting+corrosion+on+stainless+steel+(grades+304+and+316)+used+in+dairy+industry+by+biofilms+of+common+sporeformers.">Induction of pitting corrosion on stainless steel (grades 304 and 316) used in dairy industry by biofilms of common sporeformers.</a> International Journal of Dairy Technology. 71 (2), 519-531 (2018).</li><li>Marchand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+milk+production+and+processing+environments;+Influence+on+milk+quality+and+safety.">Biofilm formation in milk production and processing environments; Influence on milk quality and safety.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 11 (2), 133-147 (2012).</li><li>Silva, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+different+disinfectants+on+Bacillus+cereus+sensu+stricto+biofilms+on+stainless-steel+surfaces+in+contact+with+milk.">Efficiency of different disinfectants on Bacillus cereus sensu stricto biofilms on stainless-steel surfaces in contact with milk.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2934 (2018).</li><li>Sedlak, D. L., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+The+chlorine+dilemma.">Chemistry. The chlorine dilemma.</a> Science. 331 (6013), 42-43 (2011).</li><li>vander Veen, S., Abee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+species+biofilms+of+Listeria+monocytogenes+and+Lactobacillus+plantarum+show+enhanced+resistance+to+benzalkonium+chloride+and+peracetic+acid.">Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid.</a> International Journal of Food Microbiology. 144 (3), 421-431 (2011).</li><li>Saa Ibusquiza, P., Herrera, J. J., Cabo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+benzalkonium+chloride,+peracetic+acid+and+nisin+during+formation+of+mature+biofilms+by+Listeria+monocytogenes.">Resistance to benzalkonium chloride, peracetic acid and nisin during formation of mature biofilms by Listeria monocytogenes.</a> Food Microbiology. 28 (3), 418-425 (2011).</li><li>Goetz, C., Larouche, J., Velez Aristizabal, M., Niboucha, N., Jean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+organic+peroxyacids+for+eliminating+biofilm+preformed+by+microorganisms+isolated+from+dairy+processing+plants.">Efficacy of organic peroxyacids for eliminating biofilm preformed by microorganisms isolated from dairy processing plants.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (4), 0188921 (2022).</li><li>Vimont, A., Fliss, I., Jean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+virucidal+potential+of+organic+peroxyacids+against+norovirus+on+food-contact+surfaces.">Study of the virucidal potential of organic peroxyacids against norovirus on food-contact surfaces.</a> Food and Environmental Virology. 7 (1), 49-57 (2015).</li><li>ASTM E2562-17. Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International Available from: <a target="_blank" href="https://www.astm.org/e2562-17.html">https://www.astm.org/e2562-17.html</a> (2017)</li><li>ASTM E2871-19. Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single Tube Method. ASTM International Available from: <a target="_blank" href="https://www.astm.org/e2871-19.html">https://www.astm.org/e2871-19.html</a> (2019)</li><li>Niboucha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+different+sampling+methods+of+biofilm+formed+on+stainless-steel+surfaces+in+a+CDC+biofilm+reactor.">Comparative study of different sampling methods of biofilm formed on stainless-steel surfaces in a CDC biofilm reactor.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 892181 (2022).</li><li>ASTM E2799-17. Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay. ASTM International Available from: <a target="_blank" href="https://www.astm.org/e2799-17.html">https://www.astm.org/e2799-17.html</a> (2022)</li><li>Parker, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruggedness+and+reproducibility+of+the+MBEC+biofilm+disinfectant+efficacy+test.">Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test.</a> Journal of Microbiological Methods. 102, 55-64 (2014).</li><li>Stewart, P. S., Parker, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+antimicrobial+efficacy+against+biofilms:+A+meta-analysis.">Measuring antimicrobial efficacy against biofilms: A meta-analysis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (5), 00020 (2019).</li><li>Lindsay, D. K., Fouhy, K., Loh, M., Malakar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CDC+biofilm+bioreactor+is+a+suitable+method+to+grow+biofilms,+and+test+their+sanitiser+susceptibilities,+in+the+dairy+context.">The CDC biofilm bioreactor is a suitable method to grow biofilms, and test their sanitiser susceptibilities, in the dairy context.</a> International Dairy Journal. 126, 105264 (2022).</li><li>Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+biofilm+disinfectant+efficacy+tests.">Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 236-244 (2007).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+assessment+of+a+laboratory+method+for+growing+biofilms.">Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms.</a> Microbiology (Reading). 151, 757-762 (2005).</li><li>Williams, D. L., Woodbury, K. L., Haymond, B. S., Parker, A. E., Bloebaum, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CDC+biofilm+reactor+to+produce+mature+biofilms+on+the+surface+of+peek+membranes+for+an+in+vivo+animal+model+application.">A modified CDC biofilm reactor to produce mature biofilms on the surface of peek membranes for an in vivo animal model application.</a> Current Microbiology. 62 (6), 1657-1663 (2011).</li><li>Pieranski, M. K., Rychlowski, M., Grinholc, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Streptococcus+agalactiae+biofilm+culture+in+a+continuous+flow+system+for+photoinactivation+studies.">Optimization of Streptococcus agalactiae biofilm culture in a continuous flow system for photoinactivation studies.</a> Pathogens. 10 (9), 1212 (2021).</li><li>Mendez, E., Walker, D. K., Vipham, J., Trinetta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+CDC+biofilm+reactor+to+grow+multi-strain+Listeria+monocytogenes+biofilm.">The use of a CDC biofilm reactor to grow multi-strain Listeria monocytogenes biofilm.</a> Food Microbiology. 92, 103592 (2020).</li><li>Salgar-Chaparro, S. J., Lepkova, K., Pojtanabuntoeng, T., Darwin, A., Machuca, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+level+determines+biofilm+characteristics+and+subsequent+impact+on+microbial+corrosion+and+biocide+effectiveness.">Nutrient level determines biofilm characteristics and subsequent impact on microbial corrosion and biocide effectiveness.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (7), 02885 (2020).</li><li>Goeres, D. M., Simoes, M., Borges, A., Chaves Simoes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+Biofilm+Reactors.">Design and Fabrication of Biofilm Reactors.</a> Recent Trends in Biofilm Science and Technology. , 71-88 (2020).</li><li>Fjeld, C. S., Sch&#252;ller, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+during+hexadecane+degradation+and+the+effects+of+flow+field+and+shear+stresses.">Biofilm formation during hexadecane degradation and the effects of flow field and shear stresses.</a> Annual Transactions - The Nordic Rheology Society. 21, 341-346 (2013).</li><li>Gilmore, B. F., Hamill, T. M., Jones, D. S., Gorman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CDC+biofilm+reactor+as+a+dynamic+model+for+assessment+of+encrustation+formation+on+urological+device+materials.">Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 93 (1), 128-140 (2010).</li><li>Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+model+of+biofilm+detachment+caused+by+internal+stress+from+liquid+flow.">Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow.</a> Biotechnology and Bioengineering. 72 (2), 205-218 (2001).</li></ol>

O ensaio MBEC (biofilm microplate assay) foi o primeiro método a ser reconhecido como um teste padrão de erradicação de biofilme pela ASTM17. Nosso estudo e outros mostraram que existem duas etapas críticas ao usar este ensaio: a etapa de sonicação (tempo e potência) e o tempo de tratamento desinfetante18. Stewart e Parker também sugeriram outros parâmetros que poderiam influenciar o resultado do ensaio, como a espécie microbiana, a idade do biofilme, a relação...

A indústria de laticínios é um importante setor industrial em todo o mundo, inclusive no Canadá, onde existem mais de 10.500 fazendas leiteiras produzindo quase 90 milhões de hL de leite a cada ano1. Apesar dos rigorosos requisitos de higiene impostos na indústria de laticínios, inclusive nas plantas de processamento, o leite constitui um ótimo meio de cultura para microrganismos e, portanto, os produtos lácteos provavelmente contêm microrganismos, incluindo deterioração ou microrganismos patogênicos. Esses patógenos podem causar várias doenças; por exemplo, Salmonella sp. e Listeria monocytogenes podem causar gastroenterite e meningite, respectivamente2. Os microrganismos de deterioração podem afetar a qualidade e as propriedades organolépticas dos produtos lácteos, produzindo gases, enzimas extracelulares ou ácidos3. A aparência e a cor do leite também podem ser alteradas, por exemplo, por Pseudomonas spp.4.
Alguns desses microrganismos podem formar biofilmes em diferentes superfícies, incluindo aço inoxidável. Tais biofilmes possibilitam a persistência e multiplicação de microrganismos na superfície do equipamento e, assim, a contaminação dos laticínios5. Os biofilmes também são problemáticos devido à sua capacidade de impedir a transferência de calor e acelerar a corrosão do equipamento, levando à substituição prematura do equipamento e, portanto, a perdas econômicas6.
Os procedimentos de limpeza no local (CIP) permitem que a indústria alimentícia controle o crescimento de microrganismos. Esses procedimentos envolvem o uso sequencial de hidróxido de sódio, ácido nítrico e, por vezes, sanitizantes contendo ácido hipocloroso e ácido peracético 7,8. Embora o ácido hipocloroso seja altamente eficaz contra microrganismos, ele também reage com a matéria orgânica natural, causando a formação de subprodutos tóxicos9. O ácido peracético não gera subprodutos nocivos10; no entanto, sua efetividade contra biofilmes na indústria alimentícia é altamente variável10,11. Recentemente, outros peroxiácidos, incluindo os ácidos perpropiônico e perlático, têm sido estudados por sua atividade antimicrobiana, e parecem ser uma boa alternativa para o controle do crescimento microbiano em biofilmes12,13.
Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia de peroxiácidos orgânicos (ácidos peracético, perpropiônico e perlático e um desinfetante à base de ácido peracético) para erradicar biofilmes lácteos usando uma abordagem que combina o ensaio de concentração mínima de erradicação de biofilme (MBEC), um método estático de triagem de alto rendimento e o reator de biofilme do Centro de Controle de Doenças (CDC), um método dinâmico que imita in situ Condições. O ensaio MBEC é doravante referido como "placas de microtitulação de biofilme" no protocolo. O protocolo aqui apresentado e os resultados representativos demonstram a eficácia dos peroxiácidos orgânicos e sua potencial aplicação para o controle de biofilmes microbianos na indústria de laticínios.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.2 &#181;m filters&#160;</td>
			<td >Corning</td>
			<td >09-754-28</td>
			<td >diameter: 50 mm, PTFE- Membrane</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >316 stainless-steel disc coupon</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >RD128-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >316 stainless-steel slide coupon</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >CBR 2128-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-microtiter plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >07-200-89</td>
			<td>cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >27225</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminium stubs</td>
			<td >Electron Microscopy Science</td>
			<td >75830-10</td>
			<td>32x5mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25%</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >16220</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AB204-S/FACT Analytical balance</td>
			<td >Mettler Toledo</td>
			<td >AB204-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bacterial Vent Filter (0.45 &#181;m)</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >BST 02915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BioDestroy</td>
			<td >Groupe Sani Marc</td>
			<td >09-10215</td>
			<td>commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carboy LDPE 20 L</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >06031-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CDC biofilm reactor</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >CRB 90</td>
			<td>bioreactor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cerium (IV) sulphate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >35650-K2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal laser scanning microscope&#160; LSM 700</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dey-Engley neutralizing broth</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >D3435-500G</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMS950x + 350s gold sputter&#160;</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >14121</td>
			<td>with BDMA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl alcohol 95%, USP</td>
			<td >Greenfield global</td>
			<td >P016EA95</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ferroin indicator solution</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >318922-100ML</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filling/venting cap</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >RK-06258-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >L10316</td>
			<td >fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass flow break</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >FB 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gold with silver paint&#160;</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >12684-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating plate set</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >110V Stir Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hex screwdriver</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >CBR 5497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrogen peroxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >216763</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculating loops</td>
			<td >VWR</td>
			<td >12000-812</td>
			<td>sterile, 10 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lactic acid</td>
			<td >Laboratoire MAT</td>
			<td >LU-0200</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base</td>
			<td >Innovotech</td>
			<td >19111</td>
			<td>Biofilm microtiter plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxford agar base</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >OXCM0856B</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic coupon holder</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >CBR 2203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic slide holder rod</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >CBR 2203-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium iodide</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >P410-500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm)</td>
			<td >Wiha</td>
			<td >26015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Propionic acid</td>
			<td >Laboratoire MAT</td>
			<td >PF-0221</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sartorius BCE822-1S Entris&#174; II Basic Essential Toploading Balance</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td>&#160;UZ-11976-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope JSM-6360LV model</td>
			<td >JEOL</td>
			<td >JSM-6360LV</td>
			<td>SEM and user control interface</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >62.554.205</td>
			<td>(Lx&#216;): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Screw cap tube, 50 mL</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >62.547.205</td>
			<td>(Lx&#216;): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>&#160;12300</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium thiosulfate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >AC124270010</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sonication bath</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >15-336-122</td>
			<td>5,7 L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Starch solution</td>
			<td >Anachemia</td>
			<td >AC8615</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfuric acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >258105-500ML</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptic soy agar</td>
			<td >BD Bacto</td>
			<td >DF0369-17-6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptic soy broth</td>
			<td >BD Bacto</td>
			<td >DF0370-17-3</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubing Masterflex L/S 16 25&#39;</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >MFX0642416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubing Masterflex L/S 18 25&#39;</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >MFX0642418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tygon SPT-3350 silicon tubing&#160;</td>
			<td >Saint-Gobain</td>
			<td >ABW18NSF</td>
			<td>IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex</td>
			<td >Cole Palmer</td>
			<td >UZ-04724-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89202-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zen software</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the efficacy of organic peroxyacids for eradicating dairy biofilms using an approach combining static and dynamic methods

A presença de biofilmes na indústria de laticínios é de grande preocupação, pois eles podem levar à produção de produtos lácteos inseguros e alterados devido à sua alta resistência à maioria dos procedimentos de limpeza no local (CIP) frequentemente usados em plantas de processamento. Portanto, é imperativo desenvolver novas estratégias de controle de biofilme para a indústria de laticínios. Este protocolo tem como objetivo avaliar a eficácia de peroxiácidos orgânicos (ácidos peracético, perpropiônico e perlático e um desinfetante comercial à base de ácido peracético) para erradicar biofilmes lácteos usando uma combinação de métodos estáticos e dinâmicos. Todos os desinfetantes foram testados nas bactérias produtoras de biofilme mais fortes em um único ou misto biofilme usando o ensaio de concentração mínima de erradicação de biofilme (MBEC), um método estático de triagem de alto rendimento. Um tempo de contacto de 5 minutos com os desinfetantes nas concentrações recomendadas erradicou com sucesso os biofilmes simples e mistos. Estudos estão atualmente em andamento para confirmar essas observações usando o reator de biofilme do Centro de Controle de Doenças (CDC), um método dinâmico para imitar condições in situ . Este tipo de biorreator permite o uso de uma superfície de aço inoxidável, que constitui a maioria dos equipamentos e superfícies industriais. Os resultados preliminares do reator parecem confirmar a eficácia dos peroxiácidos orgânicos contra biofilmes. A abordagem combinada descrita neste estudo pode ser utilizada para desenvolver e testar novas formulações biológicas ou químicas para controle de biofilmes e erradicação de microrganismos.

A análise do MEV mostra a presença de biofilmes produzidos por P. azotoformans PFl1A nas estacas de microplacas de biofilme (Figura 2A). Uma estrutura tridimensional de biofilme pode ser observada. O P. azotoformans PFl1A foi previamente identificado como um forte produtor de biofilme (A570 > 1,5) utilizando placas de microtitulação de 96 poços12.
Além disso, o biofilme PFl1A de P. azotoformans qu...

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Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods

Este protocolo descreve uma abordagem que combina métodos estáticos e dinâmicos para avaliar a eficácia de peroxiácidos orgânicos para erradicar biofilmes na indústria de laticínios. Esta abordagem também pode ser usada para testar a eficácia de novas formulações biológicas ou químicas para o controle de biofilmes.

Avaliação da Eficácia dos Perácidos Orgânicos na Erradicação de Biofilmes Laticínios Usando uma Abordagem Combinando Métodos Estáticos e Dinâmicos

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their ...

Os microrganismos formadores de biofilme são uma questão importante na indústria alimentícia, incluindo a indústria de laticínios. Devido ao seu impacto negativo na qualidade dos produtos, então é importante desenvolver estratégias de controle de biofilme. Essa abordagem combina um método estático de triagem de alto rendimento e um método dinâmico que imita as condições in situ.Esses dois métodos são complementares para o estudo da eficácia dos desinfetantes contra biofilmes. Essa abordagem pode ser usada para testar novas formulações biológicas ou químicas para controlar biofilmes nos setores alimentício, médico ou ambiental. Comece por vórtice dos tubos de cultura bacteriana de Pseudomonas azotoformans.Transfira assepticamente 100 microlitros da cultura bacteriana para 10 mililitros de caldo de soja tríptico estéril ou meio TSB para atingir a concentração final de aproximadamente duas vezes 10 até a sétima UFC por mililitro. Vórtice o tubo de cultura. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, transfira 150 microlitros da cultura bacteriana diluída nos poços de placa de microtitulação de biofilme em triplicado.Carregar 150 microlitros de meio TSB em três novos poços como controle. Em seguida, incube a placa de microtitulação de biofilme a 30 graus Celsius por 24 horas sem agitação. Limpe e seque ao ar as partes do biorreator antes de colocar a lâmina plana dentro do copo de vidro de um litro preso ao suporte por uma barra magnética.Mantenha a configuração na posição vertical usando a barra de plástico presa ao lado interno da tampa do biorreator. Use a chave de fenda para colocar os cupons de aço inoxidável ou slides em suas hastes de polipropileno. Insira cupons ou deslizamentos nos orifícios da tampa sem colocar seus pinos de alinhamento nos entalhes, permitindo que o vapor escape durante a esterilização.Cubra todas as aberturas do biorreator com folha de alumínio e envolva o resto do equipamento, nomeadamente a tubulação tamanho 18 e a tubulação tamanho 16, o freio de fluxo de vidro, as tampas do recipiente, as chaves de fenda, a pinça e os filtros de 0,2 micrômetro com folha de alumínio. Autoclave o biorreator configurado em um ciclo seco a 121 graus Celsius por 20 minutos. Para realizar a primeira etapa da formação do biofilme no biorreator em modo de batela, dentro de um gabinete de segurança biológica, conecte uma extremidade da tubulação tamanho 18 ao bico de saída do biorreator e mantenha a outra extremidade envolta em folha de alumínio.Remova um cupom ou suporte deslizante da tampa do biorreator e coloque-o em um tubo estéril de 50 mililitros. Em seguida, usando uma pipeta sorológica de 50 mililitros, encha o copo do biorreator com 340 mililitros de 300 miligramas por mililitro de meio TSB através do orifício ocupado pela haste. Para inocular o meio de cultura no biorreator, adicione um mililitro de 10 à oitava UFC por mililitro de solução bacteriana de Pseudomonas azotoformans através do orifício usando uma pipeta de cinco mililitros e coloque a haste de volta à sua posição original.Posicione as hastes já colocadas nos orifícios da tampa para que os pinos caibam nos respectivos entalhes. Em seguida, coloque um filtro de purga de ar bacteriano de 0,2 micrômetro no final do tubo de menor diâmetro localizado na tampa do biorreator. O outro tubo do mesmo diâmetro permanece permanentemente entupido com uma tampa de rosca de metal ou um plugue de silicone que se fecha firmemente.Coloque o biorreator por 24 horas sobre a placa de aquecimento ajustada a 30 graus Celsius e mexa a 130 RPM. Após 24 horas, realizar a segunda etapa da formação do biofilme no biorreator em modo de fluxo contínuo. Coloque um garrafão contendo 18 litros de água destilada estéril no armário de biossegurança.Em seguida, adicione dois litros de 1000 miligramas por litro de meio de cultura TSB para obter uma concentração final de 100 miligramas por litro. Cubra o recipiente com sua tampa estéril à qual dois tubos estão conectados. O primeiro é um tubo de silicone fixado na interface da tampa para bombear o meio.O segundo, o tubo de tamanho 16, é conectado à porta externa, permitindo que o líquido flua em direção ao biorreator. Depois de conectar a tubulação de tamanho 16 à extremidade do freio de fluxo de vidro, insira este último no maior tubo na tampa do biorreator por sua outra extremidade e, em seguida, instale a tubulação de tamanho 16 na bomba peristáltica. Use outro garrafão de 20 litros para coletar o efluente do biorreator.Fixar a extremidade do tubo ligado à bica de saída do biorreactor à tampa do recipiente de resíduos. Insira um filtro de 0,2 micrômetro no tubo presente na tampa deste recipiente. Uma vez feito, ligue a bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 11,3 mililitros por minuto e deixe o sistema funcionando por 24 horas.Após 24 horas, desligue a bomba peristáltica e pare de mexer e aquecer o biorreator. Para recuperar o biofilme bacteriano, lave os cupons ou lâminas em 40 mililitros de PBS para eliminar as bactérias planctônicas. Em seguida, solte-os em um tubo cônico estéril de 50 mililitros contendo 40 mililitros de PBS.Após 30 segundos de vórtice, sonicate os tubos a 40 kilohertz por 30 segundos. Repita isso três vezes. Uma vez feito, colete os 40 mililitros de suspensão de biofilme em um tubo cônico estéril de 50 mililitros e enxágue os cupons ou lâminas com dois de solução estéril de PBS.Recupere este líquido de enxágue e adicione-o à suspensão de biofilme já recolhida. Retire a placa de microtitulação de 30 graus Celsius. Adicione 200 microlitros de PBS em três poços de uma microplaca de 96 poços.Para lavar os biofilmes e eliminar as bactérias planctônicas, transfira a tampa da microplaca de biofilme com biofilmes formados nos pinos para a microplaca de 96 poços contendo o PBS por 10 segundos. Prepare os desinfetantes nas concentrações necessárias e adicione 200 microlitros de cada concentração de desinfetante nos poços de uma nova placa de microtitulação de 96 poços em triplicata. Transfira a tampa da placa de microtitulação de biofilme para a placa de microtitulação de 96 poços contendo os desinfetantes e incube a placa à temperatura ambiente durante o tempo de exposição desejado.Em seguida, adicione 200 microlitros de caldo neutralizante Dey-Engley aos poços de uma nova placa de microtitulação de 96 poços. Transfira a tampa da placa de microtitulação de biofilme para a placa de microtitulação de 96 poços contendo o caldo neutralizante. Sele a placa de microtitulação com parafilme e coloque-a no sonicator de banho a 40 kilohertz por 30 minutos.Após 30 minutos, a partir da primeira coluna da placa sonicada, transfira 100 microlitros de biofilmes destacados para a primeira fileira de uma nova placa de microtitulação de 96 poços. Em seguida, adicione 180 microlitros de PBS estéril a uma placa de 96 poços, exceto para a primeira linha. Em seguida, transfira 20 microlitros da solução de biofilme da primeira fileira para os poços na segunda fileira contendo 180 microlitros de PBS para obter a diluição de 10 para a menos um.Em seguida, transfira 20 microlitros da segunda fileira para os poços na próxima linha para obter a diluição de 10 para menos dois. Repita isto para obter diluição entre 10 a menos cinco e 10 a menos sete. Inocular 100 microlitros da diluição desejada em TSA e incubar as placas de acordo com os parâmetros de crescimento da bactéria.Forme os biofilmes de Pseudomonas azotoformans PFLA 1 nos cupons no biorreator, remova a haste que contém os cupons e enxágue a haste dentro de um tubo cônico contendo 30 mililitros de PBS para remover células planctônicas. Solte cada cupom em um tubo cônico estéril de 50 mililitros usando uma chave de fenda. Em seguida, adicione quatro mililitros da solução de peroxiácido orgânico apropriado ou PBS para o controle.Após cinco minutos de incubação, adicione 36 mililitros de caldo neutralizante Dey-Engley. Depois de vórtice do tubo cônico por 30 segundos, sonice-os a 40 kilohertz por 30 segundos. Repita o processo três vezes para obter a suspensão de biofilme.Repita o mesmo procedimento com as outras hastes, prepare delírios em série da suspensão de biofilme e coloque a suspensão em meio TSA, conforme descrito anteriormente. A análise do SCM mostrou a presença do biofilme de Pseudomonas azotoformans PFL1A nos pinos de microplacas de biofilme. O biofilme PFL1A de Pseudomonas azotoformans formado em uma lâmina de aço inoxidável utilizando um biorreator mostrou-se muito denso e apresentou as características morfológicas de um biofilme tridimensional maduro.Os resultados das contagens bacterianas dos biofilmes desenvolvidos por este isolado no sistema dinâmico mostraram densidades celulares significativas correspondentes a 8,74 log UFC por centímetro quadrado em meio de cultura TSB e 7,86 log CFU centímetro quadrado em leite desnatado estéril. Os resultados obtidos com o isolado de B.vesicularis mostraram que o aumento da concentração de nutrientes de 100 para 900 miligramas por litro resultou em um aumento na contagem bacteriana dos biofilmes de 6,11 para 8,71 log CFU centímetros quadrados. Além disso, o crescimento significativo do biofilme foi observado quando a taxa de fluxo foi reduzida para 6,0 mililitros por minuto, indicando que certos fatores poderiam influenciar a formação de biofilme no biorreator.Nenhum dos biofilmes continha células viáveis detectáveis em cinco minutos de tempo de contato em 500 partes por milhão com perácidos orgânicos e 100.000 partes por milhão com concentrações de peróxido de hidrogênio de desinfetantes geralmente aplicados em plantas leiteiras. O SCM mostrou a estrutura tridimensional da concentração mínima de erradicação de biofilme não tratada ou biofilmes MBEC, enquanto os biofilmes MBEC tratados perderam sua conformação tridimensional. É essencial permanecer sob a condição estéril durante a realização deste protocolo.Além disso, o usuário deve lembrar que o resultado gerado está associado a um isolado e desinfetante exclusivo. A combinação de desinfetante com vibração mecânica, ultrassom ou tratamentos enzimáticos pode ser avaliada para melhorar a eficácia da erradicação do biofilme. Essa abordagem usando métodos estáticos e dinâmicos para formar biofilmes abriu o caminho para os pesquisadores rastrearem e estudarem novas formulações anti-biofilme para controlar melhor os biofilmes em vários setores.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

Aplicação de Light-resina adesivo dental para Eletrodos de montagem ou Sondas microdiálise em Experimentos crônica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Biologia

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robótica e Análise de Imagem Dinâmica de Estudos de Expressão Gênica em Tecidos Vegetais

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

A Triagem procedimento químico para Glucocorticoid Sinalização com um Sistema Reporter Zebrafish Zergling luciferase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

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Métodos para a extração de endossimbiontes da mosca branca<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

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Métodos de estadiamento Pupal períodos e medição de asa pigmentação da Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

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Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Desenvolvimento de um modelo de incremento de área basal de árvore individual usando uma abordagem linear de efeitos mistos

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...