Name: evaluation of the efficacy of organic peroxyacids for eradicating dairy biofilms using an approach combining static and dynamic methods
Uploaded: 2022-12-09T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por el Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc y el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) (RDCPJ516460-17). Agradecemos a Teresa Paniconi por la revisión crítica del manuscrito.

El trabajo contenido en este artículo requiere un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad y fue aprobado previamente (Proyecto número 119689) por el comité institucional de bioseguridad de la Universidad Laval.
NOTA: El diagrama de flujo de la Figura 1 representa un resumen de la metodología que combina enfoques estáticos y dinámicos que se utilizó para evaluar la eficacia de los peroxiácidos orgánicos para erradicar las biopelículas.
<p class="jove_t...

<ol>
	<li>Canada's dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre Available from: <a target="_blank" href="https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance">https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance</a> (2017)</li><li>Oliver, S. P., Jayarao, B. M., Almeida, R. 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K., McGuire, J., Daeschel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+and+detachment+of+bacteria+and+spores+on+food-contact+surfaces.">The adhesion and detachment of bacteria and spores on food-contact surfaces.</a> Trends in Food Science &amp; Technology. 7 (5), 152-157 (1996).</li><li>Gupta, S., Anand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pitting+corrosion+on+stainless+steel+(grades+304+and+316)+used+in+dairy+industry+by+biofilms+of+common+sporeformers.">Induction of pitting corrosion on stainless steel (grades 304 and 316) used in dairy industry by biofilms of common sporeformers.</a> International Journal of Dairy Technology. 71 (2), 519-531 (2018).</li><li>Marchand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+milk+production+and+processing+environments;+Influence+on+milk+quality+and+safety.">Biofilm formation in milk production and processing environments; Influence on milk quality and safety.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 11 (2), 133-147 (2012).</li><li>Silva, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+different+disinfectants+on+Bacillus+cereus+sensu+stricto+biofilms+on+stainless-steel+surfaces+in+contact+with+milk.">Efficiency of different disinfectants on Bacillus cereus sensu stricto biofilms on stainless-steel surfaces in contact with milk.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2934 (2018).</li><li>Sedlak, D. L., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+The+chlorine+dilemma.">Chemistry. The chlorine dilemma.</a> Science. 331 (6013), 42-43 (2011).</li><li>vander Veen, S., Abee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+species+biofilms+of+Listeria+monocytogenes+and+Lactobacillus+plantarum+show+enhanced+resistance+to+benzalkonium+chloride+and+peracetic+acid.">Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid.</a> International Journal of Food Microbiology. 144 (3), 421-431 (2011).</li><li>Saa Ibusquiza, P., Herrera, J. J., Cabo, M. 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Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International Available from: <a target="_blank" href="https://www.astm.org/e2562-17.html">https://www.astm.org/e2562-17.html</a> (2017)</li><li>ASTM E2871-19. Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single Tube Method. ASTM International Available from: <a target="_blank" href="https://www.astm.org/e2871-19.html">https://www.astm.org/e2871-19.html</a> (2019)</li><li>Niboucha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+different+sampling+methods+of+biofilm+formed+on+stainless-steel+surfaces+in+a+CDC+biofilm+reactor.">Comparative study of different sampling methods of biofilm formed on stainless-steel surfaces in a CDC biofilm reactor.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 892181 (2022).</li><li>ASTM E2799-17. Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay. ASTM International Available from: <a target="_blank" href="https://www.astm.org/e2799-17.html">https://www.astm.org/e2799-17.html</a> (2022)</li><li>Parker, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruggedness+and+reproducibility+of+the+MBEC+biofilm+disinfectant+efficacy+test.">Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test.</a> Journal of Microbiological Methods. 102, 55-64 (2014).</li><li>Stewart, P. S., Parker, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+antimicrobial+efficacy+against+biofilms:+A+meta-analysis.">Measuring antimicrobial efficacy against biofilms: A meta-analysis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (5), 00020 (2019).</li><li>Lindsay, D. K., Fouhy, K., Loh, M., Malakar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CDC+biofilm+bioreactor+is+a+suitable+method+to+grow+biofilms,+and+test+their+sanitiser+susceptibilities,+in+the+dairy+context.">The CDC biofilm bioreactor is a suitable method to grow biofilms, and test their sanitiser susceptibilities, in the dairy context.</a> International Dairy Journal. 126, 105264 (2022).</li><li>Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+biofilm+disinfectant+efficacy+tests.">Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 236-244 (2007).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+assessment+of+a+laboratory+method+for+growing+biofilms.">Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms.</a> Microbiology (Reading). 151, 757-762 (2005).</li><li>Williams, D. L., Woodbury, K. L., Haymond, B. S., Parker, A. E., Bloebaum, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+CDC+biofilm+reactor+to+produce+mature+biofilms+on+the+surface+of+peek+membranes+for+an+in+vivo+animal+model+application.">A modified CDC biofilm reactor to produce mature biofilms on the surface of peek membranes for an in vivo animal model application.</a> Current Microbiology. 62 (6), 1657-1663 (2011).</li><li>Pieranski, M. K., Rychlowski, M., Grinholc, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Streptococcus+agalactiae+biofilm+culture+in+a+continuous+flow+system+for+photoinactivation+studies.">Optimization of Streptococcus agalactiae biofilm culture in a continuous flow system for photoinactivation studies.</a> Pathogens. 10 (9), 1212 (2021).</li><li>Mendez, E., Walker, D. K., Vipham, J., Trinetta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+CDC+biofilm+reactor+to+grow+multi-strain+Listeria+monocytogenes+biofilm.">The use of a CDC biofilm reactor to grow multi-strain Listeria monocytogenes biofilm.</a> Food Microbiology. 92, 103592 (2020).</li><li>Salgar-Chaparro, S. J., Lepkova, K., Pojtanabuntoeng, T., Darwin, A., Machuca, L. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+CDC+biofilm+reactor+as+a+dynamic+model+for+assessment+of+encrustation+formation+on+urological+device+materials.">Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 93 (1), 128-140 (2010).</li><li>Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+model+of+biofilm+detachment+caused+by+internal+stress+from+liquid+flow.">Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow.</a> Biotechnology and Bioengineering. 72 (2), 205-218 (2001).</li></ol>

El ensayo MBEC (ensayo de microplaca de biopelícula) fue el primer método reconocido como una prueba estándar de erradicación de biopelícula por la ASTM17. Nuestro estudio y otros han demostrado que hay dos pasos críticos cuando se utiliza este ensayo: el paso de sonicación (tiempo y potencia) y el tiempo de tratamiento del desinfectante18. Stewart y Parker también sugirieron otros parámetros que podrían influir en el resultado del ensayo, como la especie microbia...

La industria láctea es un sector industrial importante en todo el mundo, incluso en Canadá, donde hay más de 10,500 granjas lecheras que producen casi 90 millones de hL de leche cada año1. A pesar de los estrictos requisitos de higiene impuestos en la industria láctea, incluso en las plantas de procesamiento, la leche constituye un gran medio de cultivo para microorganismos y, por lo tanto, es probable que los productos lácteos contengan microorganismos, incluido el deterioro o microorganismos patógenos. Estos patógenos pueden causar diversas enfermedades; por ejemplo, Salmonella sp. y Listeria monocytogenes pueden causar gastroenteritis y meningitis, respectivamente2. Los microorganismos de deterioro pueden afectar la calidad y las propiedades organolépticas de los productos lácteos mediante la producción de gases, enzimas extracelulares o ácidos3. La apariencia y el color de la leche también pueden verse alterados, por ejemplo, por Pseudomonas spp.4.
Algunos de estos microorganismos pueden formar biopelículas en diferentes superficies, incluido el acero inoxidable. Tales biopelículas permiten la persistencia y multiplicación de microorganismos en la superficie del equipo y, por lo tanto, la contaminación de los productos lácteos5. Los biofilms también son problemáticos debido a su capacidad para impedir la transferencia de calor y acelerar la corrosión del equipo, lo que lleva a la sustitución prematura del equipo y, por lo tanto, a pérdidas económicas6.
Los procedimientos de limpieza in situ (CIP) permiten a la industria alimentaria controlar el crecimiento de microorganismos. Estos procedimientos implican el uso secuencial de hidróxido de sodio, ácido nítrico y, a veces, desinfectantes que contienen ácido hipocloroso y ácido peracético 7,8. Aunque el ácido hipocloroso es altamente efectivo contra microorganismos, también reacciona con la materia orgánica natural, causando la formación de subproductos tóxicos9. El ácido peracético no genera subproductos nocivos10; Sin embargo, su efectividad frente a los biofilms en la industria alimentaria es muy variable10,11. Recientemente, otros peroxiácidos, incluyendo los ácidos perpropiónico y perláctico, han sido estudiados por su actividad antimicrobiana, y parecen ser una buena alternativa para el control del crecimiento microbiano en biofilms12,13.
Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar la eficacia de los peroxiácidos orgánicos (ácidos peracético, perpropiónico y perláctico y un desinfectante a base de ácido peracético) para erradicar las biopelículas lácteas utilizando un enfoque que combina el ensayo de concentración mínima de erradicación de biopelícula (MBEC), un método estático de detección de alto rendimiento y el reactor de biopelícula del Centro para el Control de Enfermedades (CDC), un método dinámico que imita in situ . condiciones. El ensayo MBEC se denominará en lo sucesivo "placas de título de microfilm de biopelícula" en el protocolo. El protocolo presentado aquí y los resultados representativos demuestran la eficacia de los peroxiácidos orgánicos y su aplicación potencial para controlar biopelículas microbianas en la industria láctea.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.2 &#181;m filters&#160;</td>
			<td >Corning</td>
			<td >09-754-28</td>
			<td >diameter: 50 mm, PTFE- Membrane</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >316 stainless-steel disc coupon</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >RD128-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >316 stainless-steel slide coupon</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >CBR 2128-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-microtiter plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >07-200-89</td>
			<td>cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >27225</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminium stubs</td>
			<td >Electron Microscopy Science</td>
			<td >75830-10</td>
			<td>32x5mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25%</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >16220</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AB204-S/FACT Analytical balance</td>
			<td >Mettler Toledo</td>
			<td >AB204-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bacterial Vent Filter (0.45 &#181;m)</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >BST 02915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BioDestroy</td>
			<td >Groupe Sani Marc</td>
			<td >09-10215</td>
			<td>commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carboy LDPE 20 L</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >06031-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CDC biofilm reactor</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >CRB 90</td>
			<td>bioreactor</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cerium (IV) sulphate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >35650-K2</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal laser scanning microscope&#160; LSM 700</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dey-Engley neutralizing broth</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >D3435-500G</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EMS950x + 350s gold sputter&#160;</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epoxy resin</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >14121</td>
			<td>with BDMA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl alcohol 95%, USP</td>
			<td >Greenfield global</td>
			<td >P016EA95</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ferroin indicator solution</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >318922-100ML</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filling/venting cap</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >RK-06258-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >L10316</td>
			<td >fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass flow break</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >FB 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gold with silver paint&#160;</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >12684-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating plate set</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >110V Stir Plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hex screwdriver</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >CBR 5497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrogen peroxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >216763</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inoculating loops</td>
			<td >VWR</td>
			<td >12000-812</td>
			<td>sterile, 10 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lactic acid</td>
			<td >Laboratoire MAT</td>
			<td >LU-0200</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base</td>
			<td >Innovotech</td>
			<td >19111</td>
			<td>Biofilm microtiter plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxford agar base</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >OXCM0856B</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic coupon holder</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >CBR 2203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic slide holder rod</td>
			<td >Biosurface Technologies Corporation</td>
			<td >CBR 2203-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium iodide</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >P410-500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm)</td>
			<td >Wiha</td>
			<td >26015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Propionic acid</td>
			<td >Laboratoire MAT</td>
			<td >PF-0221</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sartorius BCE822-1S Entris&#174; II Basic Essential Toploading Balance</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td>&#160;UZ-11976-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope JSM-6360LV model</td>
			<td >JEOL</td>
			<td >JSM-6360LV</td>
			<td>SEM and user control interface</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >62.554.205</td>
			<td>(Lx&#216;): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Screw cap tube, 50 mL</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >62.547.205</td>
			<td>(Lx&#216;): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>&#160;12300</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium thiosulfate</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >AC124270010</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sonication bath</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >15-336-122</td>
			<td>5,7 L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Starch solution</td>
			<td >Anachemia</td>
			<td >AC8615</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfuric acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >258105-500ML</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptic soy agar</td>
			<td >BD Bacto</td>
			<td >DF0369-17-6</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptic soy broth</td>
			<td >BD Bacto</td>
			<td >DF0370-17-3</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubing Masterflex L/S 16 25&#39;</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >MFX0642416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tubing Masterflex L/S 18 25&#39;</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >MFX0642418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tygon SPT-3350 silicon tubing&#160;</td>
			<td >Saint-Gobain</td>
			<td >ABW18NSF</td>
			<td>IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex</td>
			<td >Cole Palmer</td>
			<td >UZ-04724-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath&#160;</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89202-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zen software</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the efficacy of organic peroxyacids for eradicating dairy biofilms using an approach combining static and dynamic methods

La presencia de biopelículas en la industria láctea es motivo de gran preocupación, ya que pueden conducir a la producción de productos lácteos inseguros y alterados debido a su alta resistencia a la mayoría de los procedimientos de limpieza in situ (CIP) utilizados con frecuencia en las plantas de procesamiento. Por lo tanto, es imperativo desarrollar nuevas estrategias de control de biopelículas para la industria láctea. Este protocolo tiene como objetivo evaluar la eficacia de los peroxiácidos orgánicos (ácidos peracético, perpropiónico y perláctico y un desinfectante comercial a base de ácido peracético) para erradicar las biopelículas lácteas utilizando una combinación de métodos estáticos y dinámicos. Todos los desinfectantes se probaron en las bacterias productoras de biopelícula más fuertes, ya sea en una biopelícula única o mixta, utilizando el ensayo de concentración mínima de erradicación de biopelícula (MBEC), un método estático de detección de alto rendimiento. Un tiempo de contacto de 5 min con los desinfectantes a las concentraciones recomendadas erradicó con éxito tanto las biopelículas simples como las mixtas. Actualmente se están realizando estudios para confirmar estas observaciones utilizando el reactor de biopelícula del Centro para el Control de Enfermedades (CDC), un método dinámico para imitar las condiciones in situ . Este tipo de biorreactor permite el uso de una superficie de acero inoxidable, que constituye la mayoría de los equipos y superficies industriales. Los resultados preliminares del reactor parecen confirmar la eficacia de los peroxiácidos orgánicos contra las biopelículas. El enfoque combinado descrito en este estudio se puede utilizar para desarrollar y probar nuevas formulaciones biológicas o químicas para controlar biopelículas y erradicar microorganismos.

El análisis SEM muestra la presencia de biofilms producidos por P. azotoformans PFl1A en las clavijas de microplacas del biofilm (Figura 2A). Se puede observar una estructura tridimensional de biofilm. El P. azotoformans PFl1A fue identificado previamente como un fuerte productor de biofilm (A570 > 1.5) utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos12.
Además, la biopelícula PFl1A de P. azotoformans...

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Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods

Este protocolo describe un enfoque que combina métodos estáticos y dinámicos para evaluar la eficacia de los peroxiácidos orgánicos para erradicar las biopelículas en la industria láctea. Este enfoque también se puede utilizar para probar la eficacia de nuevas formulaciones biológicas o químicas para controlar las biopelículas.

Evaluación de la eficacia de los peroxiácidos orgánicos para la erradicación de biofilms lácteos utilizando un enfoque que combina métodos estáticos y dinámicos

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their ...

Los microorganismos formadores de biopelículas son un problema importante en la industria alimentaria, incluida la industria láctea. Debido a su impacto negativo en la calidad de los productos, entonces es importante desarrollar estrategias de control de biopelículas. Este enfoque combina un método de cribado estático de alto rendimiento y un método dinámico que imita las condiciones in situ.Estos dos métodos son complementarios para estudiar la eficacia de los desinfectantes contra las biopelículas. Este enfoque se puede utilizar para probar nuevas formulaciones biológicas o químicas para controlar las biopelículas en los sectores alimentario, médico o ambiental. Comience por vortexing los tubos de cultivo bacteriano Pseudomonas azotoformans.Transfiera asépticamente 100 microlitros del cultivo bacteriano a 10 mililitros de caldo de soja tríptico estéril o medio TSB para lograr la concentración final de aproximadamente dos veces 10 a la séptima UFC por mililitro. Vórtice el tubo de cultivo. Luego, utilizando una pipeta multicanal, transfiera 150 microlitros del cultivo bacteriano diluido en los pocillos de la placa de microtitulación de biopelícula por triplicado.Cargar 150 microlitros de TSB medio en tres nuevos pozos como control. A continuación, incube la placa de microtitulación de biofilm a 30 grados centígrados durante 24 horas sin agitación. Limpie y seque al aire las partes del biorreactor antes de colocar la cuchilla plana dentro del vaso de precipitados de vidrio de un litro unido al soporte por una barra magnética.Mantenga la configuración en posición vertical utilizando la barra de plástico unida al lado interior de la tapa del biorreactor. Utilice el destornillador para colocar los cupones o guías de acero inoxidable en sus varillas de polipropileno. Inserte cupones o guías en los orificios de la tapa sin colocar sus pasadores de alineación en las muescas que permitan que el vapor escape durante la esterilización.Cubra todas las rejillas de ventilación del biorreactor con papel de aluminio y envuelva el resto del equipo, a saber, el tubo de tamaño 18 y el tubo de tamaño 16, el freno de flujo de vidrio, las tapas del contenedor, los destornilladores, las pinzas y los filtros de 0,2 micrómetros con papel de aluminio. Autoclave el biorreactor configurado en un ciclo seco a 121 grados centígrados durante 20 minutos. Para realizar el primer paso de la formación de biopelícula en el biorreactor en modo discontinuo, dentro de un gabinete de seguridad biológica, conecte un extremo del tubo de tamaño 18 al pico de salida del biorreactor y mantenga el otro extremo envuelto en papel de aluminio.Retire un cupón o portaportaobjetos de la tapa del biorreactor y colóquelo en un tubo estéril de 50 mililitros. Luego, utilizando una pipeta serológica de 50 mililitros, llene el vaso de precipitados del biorreactor con 340 mililitros de 300 miligramos por mililitro de medio TSB a través del orificio ocupado por la varilla. Para inocular el medio de cultivo en el biorreactor, añadir un mililitro de 10 a la octava UFC por mililitro de solución bacteriana de Pseudomonas azotoformans a través del orificio utilizando una pipeta de cinco mililitros y volver a colocar la varilla en su posición original.Coloque las varillas ya colocadas en los orificios de la tapa para que los pasadores encajen en las muescas respectivas. Luego coloque un filtro de purga de aire bacteriano de 0.2 micrómetros en el extremo del tubo de diámetro más pequeño ubicado en la tapa del biorreactor. El otro tubo del mismo diámetro permanece permanentemente tapado con un tapón de rosca de metal o un tapón de silicona que se cierra herméticamente.Coloque el biorreactor durante 24 horas sobre la placa calefactora fijada a 30 grados centígrados y revuelva a 130 RPM. Después de 24 horas, realice el segundo paso de la formación de biopelícula en el biorreactor en modo de flujo continuo. Coloque una garrafa que contenga 18 litros de agua destilada estéril en el gabinete de bioseguridad.Luego agregue dos litros de 1000 miligramos por litro de medio de cultivo de cucharada para obtener una concentración final de 100 miligramos por litro. Cubra el recipiente con su tapón estéril al que están conectados dos tubos. El primero es un tubo de silicona fijado en la interfaz de la tapa para bombear el medio.El segundo, el tubo de tamaño 16, está conectado al puerto externo permitiendo que el líquido fluya hacia el biorreactor. Después de conectar el tubo de tamaño 16 al extremo del freno de flujo de vidrio, inserte este último en el tubo más grande de la tapa del biorreactor por su otro extremo y luego instale el tubo de tamaño 16 en la bomba peristáltica. Utilice otra garrafa de 20 litros para recoger el efluente del biorreactor.Fije el extremo del tubo conectado al pico de salida del biorreactor a la tapa del contenedor de residuos. Inserte un filtro de 0,2 micrómetros en el tubo presente en la tapa de este recipiente. Una vez hecho esto, arranque la bomba peristáltica a un caudal de 11,3 mililitros por minuto y deje el sistema funcionando durante 24 horas.Después de 24 horas, apague la bomba peristáltica y deje de agitar y calentar el biorreactor. Para recuperar el biofilm bacteriano, enjuague los cupones o portaobjetos en 40 mililitros de PBS para eliminar las bacterias planctónicas. Luego suéltelos en un tubo cónico estéril de 50 mililitros que contiene 40 mililitros de PBS.Después de 30 segundos de vórtice, sonicar los tubos a 40 kilohercios durante 30 segundos. Repita esto tres veces. Una vez hecho esto, recoja los 40 mililitros de suspensión de biofilm en un tubo cónico estéril de 50 mililitros y enjuague los cupones o portaobjetos con dos de solución estéril de PBS.Recupere este líquido de enjuague y agréguelo a la suspensión de biofilm ya recolectada. Saque la placa de microtitulación a partir de 30 grados centígrados. Agregue 200 microlitros de PBS en tres pocillos de una microplaca de 96 pocillos.Para lavar las biopelículas y eliminar las bacterias planctónicas, transfiera la tapa de la microplaca de biopelícula con biopelículas formadas en las clavijas a la microplaca de 96 pocillos que contiene el PBS durante 10 segundos. Prepare los desinfectantes en las concentraciones requeridas y agregue 200 microlitros de cada concentración de desinfectante en los pocillos de una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos por triplicado. Transfiera la tapa de la placa de microtitulación de biofilm a la placa de microtitulación de 96 pocillos que contiene los desinfectantes e incube la placa a temperatura ambiente durante el tiempo de exposición deseado.A continuación, agregue 200 microlitros de caldo neutralizante Dey-Engley a los pocillos de una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos. Transfiera la tapa de la placa de microtitulación de biopelícula a la placa de microtitulación de 96 pocillos que contiene el caldo neutralizante. Selle la placa de microtitulación con parafilm y colóquela en el sonicador de baño a 40 kilohercios durante 30 minutos.Después de 30 minutos, desde la primera columna de la placa sonicada, transfiera 100 microlitros de biopelículas separadas a la primera fila de una nueva placa de microtitulación de 96 pocillos. Luego agregue 180 microlitros de PBS estéril a una placa de 96 pocillos, excepto la primera fila. A continuación, transfiera 20 microlitros de la solución de biopelícula de la primera fila a los pocillos en la segunda fila que contienen 180 microlitros de PBS para lograr la dilución de 10 a menos uno.Luego transfiera 20 microlitros de la segunda fila a los pozos en la siguiente fila para lograr la dilución de 10 a menos dos. Repita esto para obtener una dilución entre 10 a menos cinco y 10 a menos siete. Inocular 100 microlitros de la dilución deseada en TSA e incubar las placas según los parámetros de crecimiento de la bacteria.Forme las biopelículas PFLA 1 de Pseudomonas azotoformans en los cupones en el biorreactor, retire la varilla que contiene los cupones y enjuague la varilla dentro de un tubo cónico que contiene 30 mililitros de PBS para eliminar las células planctónicas. Coloque cada cupón en un tubo cónico estéril de 50 mililitros con un destornillador. Luego agregue cuatro mililitros de la solución orgánica de peroxiácido apropiada o PBS para el control.Después de cinco minutos de incubación, agregue 36 mililitros de caldo neutralizante Dey-Engley. Después de vortex el tubo cónico durante 30 segundos, sonicarlo a 40 kilohercios durante 30 segundos. Repita el proceso tres veces para obtener la suspensión de biofilm.Repita el mismo procedimiento con las otras varillas, prepare delirios seriados de la suspensión de biopelícula y coloque la suspensión en medio TSA como se describió anteriormente. El análisis SCM mostró la presencia del biofilm por Pseudomonas azotoformans PFL1A en las clavijas de microplacas del biofilm. La biopelícula PFL1A de Pseudomonas azotoformans formada en un portaobjetos de acero inoxidable utilizando un biorreactor parecía muy densa y mostraba las características morfológicas de una biopelícula tridimensional madura.Los resultados de los recuentos bacterianos de las biopelículas desarrolladas por este aislado en el sistema dinámico mostraron densidades celulares significativas correspondientes a 8,74 log UFC por centímetro cuadrado en medio de cultivo TSB y 7,86 log UFC centímetro cuadrado en leche descremada estéril. Los resultados obtenidos con el aislado de B.vesicularis mostraron que el aumento en la concentración de nutrientes de 100 a 900 miligramos por litro resultó en un aumento en el recuento bacteriano de las biopelículas de 6.11 a 8.71 log CFU centímetro cuadrado. Además, se observó un crecimiento significativo de la biopelícula cuando el caudal se redujo a 6,0 mililitros por minuto, lo que indica que ciertos factores podrían influir en la formación de biopelículas en el biorreactor.Ninguna de las biopelículas contenía células viables detectables a cinco minutos de tiempo de contacto en 500 partes por millón con peroxiácidos orgánicos y 100.000 partes por millón con concentraciones de peróxido de hidrógeno de desinfectantes generalmente aplicados en plantas lecheras. El SCM mostró la estructura tridimensional de la concentración mínima de erradicación de biopelículas no tratadas o biopelículas MBEC, mientras que las biopelículas MBEC tratadas perdieron su conformación tridimensional. Es esencial permanecer bajo la condición estéril mientras se realiza este protocolo.Además, el usuario debe recordar que los resultados generados están asociados con un aislado y desinfectante únicos. La combinación de desinfectante con vibración mecánica, ultrasonido o tratamientos enzimáticos podría evaluarse para mejorar la eficacia de la erradicación de biopelículas. Este enfoque que utiliza métodos estáticos y dinámicos para formar biopelículas allanó el camino para que los investigadores examinaran y estudiaran nuevas formulaciones antibiopelículas para controlar mejor las biopelículas en diversos sectores.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

Aplicación de curado con luz Resina Adhesivo Dental para los electrodos de montaje o sondas de microdiálisis en experimentos crónica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Investigación

Biología

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robótica y Análisis de Imagen Dinámica de Estudios de la expresión génica en los tejidos vegetales

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Un procedimiento de detección química de glucocorticoides Señalización con un sistema indicador de pez cebra Larva luciferasa

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Métodos para la extracción de endosimbiontes de la mosca blanca<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

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Métodos para pupa períodos de prueba y medición de pigmentación de ala de Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Desarrollo de un modelo de incremento de área basal de árbol individual mediante un enfoque lineal de efectos mixtos

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...