Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

De auteurs willen Kersi Pestonjamasp van de Moores Cancer Center imaging core facility bedanken voor hulp bij de microscopen UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Dit werk werd bovendien ondersteund door een JoVE-publicatiebeurs (JRW), evenals gulle giften uit de nalatenschap van Elisabeth en Ad Creemers, de Euske Family Foundation, het Gastrointestinal Cancer Research Fund en het Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).

De deidentificatie en verwerving van alle weefsels werden uitgevoerd onder een IRB-goedgekeurd protocol aan de Universiteit van Californië, San Diego.
1. Bereiding van menselijke PMP-weefsels voor weefselbewerking en -kweek
<ol><li>Transport van tumorweefsels en microdissectie<ol><li>Bereid de transport- en cultuurmedia voor: voltooi 10% (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutamine, 1% Penicilline/Streptomycine (Pen Strep).</li>
		<li>Bij aankomst...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).</li><li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture.">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li><li>Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+mouse+models+of+pseudomyxoma+peritonei+recapitulate+the+human+inflammatory+tumor+microenvironment.">Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment.">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

Dit manuscript beschrijft een techniek die kan worden gebruikt om menselijke pseudomyxoma peritonei (PMP) tumormonsters te kweken, te ondervragen en te analyseren. We hebben talloze downstream functionele assays gebruikt om de tumorimmuunmicro-omgeving te ondervragen en een platform voor bench-to-bedside testen.
Hoewel de methode zeer efficiënt is in onze handen, vereist het enige oefening om tumormonsters te snijden met behulp van een vibratoom. We kwamen namelijk problemen tegen die te wijt...

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is een zeldzaam syndroom met een incidentie van 1 per miljoen mensen per jaar1. De meeste PMP-gevallen worden veroorzaakt door metastasen van appendiceale neoplasmata. Aangezien muizen geen mensachtige appendix hebben, blijft het modelleren van dit type kanker uiterst uitdagend. Hoewel de primaire ziekte vaak te genezen is door chirurgische resectie, zijn de behandelingsopties voor gemetastaseerde ziekte beperkt. Daarom is de reden voor het ontwikkelen van dit nieuwe organotypische slice-model het bestuderen van de pathobiologie van PMP. Tot op heden zijn er geen appendiceale organoïde modellen die eeuwigdurend kunnen worden gekweekt; Een recent model bleek echter nuttig te zijn voor het farmacologisch testen van therapeutische middelen en immunotherapie2. Als zodanig hebben we een organotypisch plakkweeksysteem aangepast, dat is gebruikt bij andere soorten menselijke kankers, zoals hersenen, borsten, pancreas, longen, eierstokken en anderen 3,4,5,6.
Naast appendiceale neoplasmata is PMP af en toe het gevolg van andere tumortypen, waaronder eierstokkanker7, en in zeldzame omstandigheden intraductale papillaire mucineuze neoplasmata8 en darmkanker9. Bovendien hebben deze tumoren de neiging om langzaam te groeien, met slechte enentpercentages in patiënt-afgeleide xenograft (PDX) -modellen10,11. Gezien deze uitdagingen is er een onvervulde behoefte om modellen te ontwikkelen om deze ziekte te bestuderen om de pathobiologie van PMP te begrijpen, en hoe deze kankercellen: worden gerekruteerd naar de peritoneale oppervlakken, prolifereren en ontsnappen aan immuunsurveillance.
Hoewel gesneden uit de systemische vasculaire circulatie, bevatten tumorplakken cellulaire en acellulaire componenten, waaronder de extracellulaire matrix, stromale cellen, immuuncellen, kankercellen, endotheelcellen en zenuwen. Deze semi-intacte micro-omgeving maakt het functioneel onderzoek van deze celtypen mogelijk, wat uniek voordelig is in vergelijking met 3D-organoïde culturen, die alleen uit kankercellen bestaan12. Hoewel organotypische plakculturen in sommige opzichten voordelig zijn, zijn ze ook inherent een op lage doorvoer gebaseerde benadering, vergeleken met 3D-organoïden, die kunnen worden uitgebreid en geschikt zijn voor multiplexed experimentele therapeutische geneesmiddelenscreening13,14,15. In het geval van PMP zijn er geen rapporten die een betrouwbare vaststelling en eeuwigdurende doorgifte van PMP-afgeleide organoïden documenteren16. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de langzaam groeiende aard van PMP-afgeleide tumorcellen, evenals het lage aantal kwaadaardige epitheelcellen in deze mucineuze tumoren. Gezien de noodzaak om modellen te ontwikkelen om PMP te bestuderen, zijn organotypische plakjes bij uitstek geschikt om deze ziekte te bestuderen. We presenteren een protocol voor het voorbereiden, in beeld brengen en analyseren van PMP van menselijke exemplaren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is een zeldzame aandoening die het gevolg is van de verspreiding van een mucineuze primaire tumor en de resulterende accumulatie van mucine-afscheidende tumorcellen in de peritoneale holte. PMP kan voortkomen uit verschillende soorten kanker, waaronder appendiceale, eierstok- en colorectale, hoewel appendiceale neoplasmata veruit de meest voorkomende etiologie zijn. PMP is een uitdaging om te bestuderen vanwege de (1) zeldzaamheid, (2) beperkte muizenmodellen en (3) mucineuze, acellulaire histologie. De hier gepresenteerde methode maakt real-time visualisatie en ondervraging van deze tumortypen mogelijk met behulp van patiënt-afgeleide ex vivo organotypische plakjes in een preparaat waarbij de tumormicro-omgeving (TME) intact blijft. In dit protocol beschrijven we eerst de bereiding van tumorplakken met behulp van een vibratoom en vervolgens een langetermijncultuur. Ten tweede beschrijven we confocale beeldvorming van tumorplakken en hoe functionele uitlezingen van levensvatbaarheid, calciumbeeldvorming en lokale proliferatie kunnen worden gevolgd. Kortom, plakjes worden geladen met beeldvormende kleurstoffen en worden in een beeldvormingskamer geplaatst die op een confocale microscoop kan worden gemonteerd. Time-lapse-video's en confocale afbeeldingen worden gebruikt om de initiële levensvatbaarheid en cellulaire functionaliteit te beoordelen. Deze procedure onderzoekt ook translationele cellulaire beweging en paracriene signaleringsinteracties in de TME. Ten slotte beschrijven we een dissociatieprotocol voor tumorplakken dat moet worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse. Kwantitatieve flowcytometrie-analyse kan worden gebruikt voor bench-to-bedside therapeutische testen om veranderingen te bepalen die optreden in het immuunlandschap en de epitheelcelinhoud.

Kortom, menselijke tumormonsters van PMP worden verkregen onder een IRB-goedgekeurd protocol. Het weefsel wordt geprepareerd, micro-ontleed en gestold in een agarose-mal om te worden gesneden met behulp van een vibratoom (figuur 1A; Video 1). Eenmaal gesneden, worden weefselplakken geplaatst en gekweekt op permeabele insertmembranen (figuur 1B), die kunnen worden gebruikt voor beeldvormingstests in situ, evenals voor cellulaire en funct...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

We beschrijven een protocol voor de productie, cultuur en visualisatie van menselijke kankers, die zijn uitgezaaid naar de peritoneale oppervlakken. Reseceerde tumormonsters worden gesneden met behulp van een vibratoom en gekweekt op permeabele inserts voor verhoogde oxygenatie en levensvatbaarheid, gevolgd door beeldvorming en downstream-analyses met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Cultuur en beeldvorming van ex vivo organotypische pseudomyxoma peritonei tumorplakken van gereseceerde menselijke tumorspecimens

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Dit onderzoek toont een nieuwe benadering van de studie van appendiceale kankertherapieën en pathobiologie in een preklinische setting. Deze methoden kunnen breder toepasbaar zijn op de studie van andere maligniteiten. Appendiceale kanker is moeilijk te bestuderen gezien de lage incidentie bij afwezigheid van een appendix bij muizen voor ziektemodellering.Deze techniek maakt de studie van celinteracties binnen de micro-omgeving van de tumor mogelijk. Deze methode kan worden toegepast om de biologie te bestuderen van meerdere soorten kankers die de neiging hebben om uit te zaaien naar het omentum, zoals colorectale en eierstokkanker. Begin met het voorbereiden van de transport- en cultuurmedia.Bij aankomst van het weefsel, breng de pseudomyxoma peritonei tumorweefsels over in 35 complete DMEM met schalen met een diameter van zes centimeter. Naast het verwijderen van vloeibaar mucine of zeer mucineuze weefselgebieden, verwijdert u elk weefsel dat moeilijk te snijden is met een scalpel. Snijd tumorweefselknobbels grofweg in een kubus centimeter kleinere stukjes.voor agarosepreparatie en weefselinsluiting, bereid een 5% -oplossing van laagsmeltende agarose in PBS zonder foetaal runderserum of FBS op dezelfde dag als weefsels aankomen. Voeg de vloeibare 5% agarose-oplossing toe aan de schaal van zes centimeter met twee tot drie kleinere tumormonsters totdat deze het monster bedekt. Plaats de ingesloten weefsels gedurende 30 minuten in een koelkast van vier graden Celsius.Demonteer de weefselmonsters op het vibratoom, verwijder de gestolde vijzel uit de koelkast en snijd de agaroseblokjes iets groter dan de breedte van het weefsel met behulp van een scalpel. Breng superlijm aan op de vibratome fase en plaats de agaroseblokje voorzichtig op de superlijm gedurende één tot twee minuten voor bevestiging. Bevestig het mes aan het vibratoom en stel de dikte van het weefselgedeelte in op ongeveer 150 tot 250 micron voor optimale stroomafwaartse beeldvorming.Om de weefselplakken te kweken, bereidt u een doorlatende insertplaat voor door twee milliliter complete DMEM-media toe te voegen boven het permeabele membraan en drie milliliter onder het permeabele membraan. Til vervolgens voorzichtig de weefselplakken uit de snijkamer van het vibratoom met een dunne penseel en plaats twee tot vier plakjes in doorlatende kweekschalen met volledige DMEM. Kweek de plakjes maximaal zeven dagen bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.Voeg tijdens mediavervanging elke 24 uur bortezomib toe als controles voor celdoding en testbare chemotherapieën 5-Fluorouracil of 5-FU aan de kweekmedia om farmacologische interventie uit te voeren. Plaats tumorplakken voor confocale beeldvormingsanalyse in een enkele put van een schaal met 12 putten met PBS met 1% FBS. Voor calciumbeeldvormingsexperimenten, in plaats van PBS, incuberen de plakjes in een extra cellulaire calciumoplossing.Vlekmonsters met beeldvormende kleurstoffen om de levensvatbaarheid van weefselplakken te bepalen. Incubeer gedurende 10 minuten tot een uur na het toevoegen van de levensvatbaarheidskleurstof. Breng na incubatie de plakjes over naar een optisch heldere petrischaal met glazen bodem met PBS met 1% FBS om te worden gebruikt voor beeldvorming op een confocaal beeldvormingsapparaat.Snijd een klein stukje van het uiteinde van een pipetpunt van één milliliter om de opening te verbreden, waardoor krachtige mechanische dissociatie door pipetteren mogelijk is. Incubeer plakjes bij 37 graden Celsius met rotatie gedurende vijf tot 15 minuten in één milliliter verteringsbuffer, met krachtige weefselverstoring twee tot drie keer tijdens incubatie met behulp van mechanische dissociatie. Zodra het weefsel is verteerd, brengt u het verstoorde weefsel over met verteringsmedia op een 70 micrometer filter dat bovenop een conische buis van 50 milliliter is geplaatst.Pluk grotere stukken met een steriele tang of een pipet. Gebruik de stompe achterkant van een plastic spuit van vijf milliliter, pureer grotere niet-gedissocieerde plakjes en was ze met vier milliliter PBS met 2% FBS. Neem het gedissocieerde celsupernatant en centrifugeer op 300G gedurende vijf tot 10 minuten.Verwijder het supernatant en was de pellet met één milliliter PBS met 2% FBS. Om het monster voor te bereiden op flowcytometrie, voegt u de blokkeringsbuffer toe die 50 microliter humaan FC-blok bevat en incubeert u gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voer extra cellulaire kleuring uit met behulp van de respectieve antilichamen in 50 microliter PBS met 2% FBS.Aliquot vijf milliliter complete media voor controle- en behandelingsomstandigheden. Voeg op de twee tot vier plakjes die op de doorlatende schalen zijn verguld, de media van de aliquots van de controlebehandeling en de aanvullende combinatietherapieën toe die moeten worden gebruikt voor downstream levensvatbaarheid, levende dode-analyse. Laat weefselplakken twee tot vijf dagen in een cultuur met volledige DMEM zitten, waarbij je om de dag van medium verandert.Voeg voor een luminescerende levensvatbaarheidsanalyse 500 microliter PBS toe aan een schaal met 12 putten en breng de sequentieel afgestemde weefselplakken over naar de PBS-oplossing met behulp van een penseel of een pipet van één milliliter. Verwijder de PBS uit de segmenten. Voeg 500 microliter van de luminescerende levensvatbaarheidsoplossing per aandoening toe en incuber met een langzame rotatie op de shaker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten voordat de luminescentie wordt afgelezen met behulp van een luminescentieplaatlezer.De mucinekleuring in weefselplakken werd gevisualiseerd met behulp van periodieke zuurverschuivingskleuring en mucine-specifieke antilichamen. Incubatie in calceïne AM en propidiumjodide bepaalde de gezondheid en levensvatbaarheid. De kernen overlapten de cellen die tijdens de kweek werden geprolifereerd.Deze resultaten werden gekwantificeerd om het aantal prolifererende cellen in de tumorschijf te bepalen. De plakjes geïncubeerd in CD11b PE geconjugeerd antilichaam en Fluo-4 AM, gelabeld de lokale immuuncellen in CTU. Pseudocolor geschaalde afbeeldingen die intracellulaire calciumniveaus tonen, maakten het mogelijk om differentiële niveaus van intracellulair calcium te visualiseren.Spontane activiteit gevolgd en tijd verstreken voor voor, tijdens en na intercellulaire calciumrespons binnen de gemarkeerde CD11b-positieve immuuncel wordt hier weergegeven. De ruwe sporen van calciumresponsen in de CD11b-immuuncel, samen met andere responsieve en niet-responsieve cellen werden gekwantificeerd. Representatieve resultaten van immunotypering van een tumormonster van een patiënt met pseudomyxoma peritonei worden hier weergegeven.Kwantificering van het tumorimmunoprofiel toonde aan dat het donormonster 337 hoge niveaus van M2-macrofagen heeft, wat aangeeft dat het gebruik van pseudomyxoma peritonei-afgeleide weefselplakken de ondervraging van het unieke donorcellulaire landschap van de tumormonsters van de patiënt mogelijk maakte. Farmacotypering en downstream analyse van weefselplakken van pseudomyxoma peritonei menselijke weefsels toonden het doden van cellen in tumorplakken zoals bevestigd door cytotoxiciteitsanalyse en tunnel confocale beeldvorming. Als reactie op het cytotoxische geneesmiddel, bortezomib en 5-fluorouracil.Luminescerende levensvatbaarheidsanalyse werd uitgevoerd met behulp van sequentieel gematchte plakjes. Succesvolle productie van plakjes van mucineuze tumoren vereist zorgvuldige dissectie en verwijdering van cellulaire en acellulaire weefselcomponenten zoals vet en dicht buikwandweefsel. Deze techniek kan het mogelijk maken om interacties tussen kankercellen en meerdere celtypen in de micro-omgeving van de tumor te modelleren, zoals interacties tussen vet-, vasculaire en immuuncellen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo beeldvorming en Kwantatie van de gastheer Angiogenic respons in zebravis tumor xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...