Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Kersi Pestonjamasp del centro central de imágenes del Moores Cancer Center por su ayuda con la subvención 2P30CA023100 del Centro de Apoyo Especializado para el Cáncer P30 del Centro de Apoyo Especializado para el Cáncer de UCSD con los microscopios. Este trabajo fue apoyado adicionalmente por una subvención de publicación JoVE (JRW), así como generosas donaciones del patrimonio de Elisabeth y Ad Creemers, la Fundación de la Familia Euske, el Fondo de Investigación del Cáncer Gastrointestinal y el Fondo de Investigación de Metástasis Peritoneal (AML).

La desidentificación y adquisición de todos los tejidos se realizó bajo un protocolo aprobado por el IRB en la Universidad de California, San Diego.
1. Preparación de tejidos PMP humanos para procesamiento y cultivo de tejidos
<ol><li>Transporte de tejidos tumorales y microdisección<ol><li>Preparar los medios de transporte y cultivo: completar 10% (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1% Penicilina/Estreptomicina (Pen Strep).</li>
		<l...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).</li><li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture.">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li><li>Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+mouse+models+of+pseudomyxoma+peritonei+recapitulate+the+human+inflammatory+tumor+microenvironment.">Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment.">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

Este manuscrito describe una técnica que se puede utilizar para cultivar, interrogar y analizar muestras tumorales de pseudomixoma peritonei humano (PMP). Hemos utilizado numerosos ensayos funcionales posteriores para interrogar el microambiente inmune del tumor y una plataforma para pruebas de banco a cabecera.
Si bien el método es altamente eficiente en nuestras manos, requerirá algo de práctica para cortar muestras tumorales usando un vibratomo. Es decir, encontramos problemas que se de...

El pseudomixoma peritonei (PMP) es un síndrome raro con una tasa de incidencia de 1 por millón de personas por año1. La mayoría de los casos de PMP son causados por metástasis de neoplasias apendiculares. Dado que los ratones no tienen un apéndice similar al humano, modelar este tipo de cáncer sigue siendo extremadamente desafiante. Si bien la enfermedad primaria a menudo se puede curar mediante resección quirúrgica, las opciones de tratamiento para la enfermedad metastásica son limitadas. Por lo tanto, la razón para desarrollar este nuevo modelo de corte organotípico es estudiar la patobiología de PMP. Hasta la fecha, no hay modelos organoides apendiculares que puedan cultivarse perpetuamente; Sin embargo, un modelo reciente demostró ser útil para las pruebas farmacológicas de agentes terapéuticos e inmunoterapia2. Como tal, hemos adaptado un sistema organotípico de cultivo de cortes, que se ha utilizado en otros tipos de cánceres humanos, como cerebro, mama, páncreas, pulmón, ovario y otros 3,4,5,6.
Además de las neoplasias apendiculares, la PMP ocasionalmente resulta de otros tipos de tumores, incluidos los cánceres de ovario7 y, en raras circunstancias, las neoplasias mucinosas papilares intraductales8 y el cáncer de colon9. Además, estos tumores tienden a crecer lentamente, con tasas de injerto pobres en modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX)10,11. Dados estos desafíos, existe una necesidad insatisfecha de desarrollar modelos para estudiar esta enfermedad para comenzar a comprender la patobiología de PMP y cómo estas células cancerosas: son reclutadas a las superficies peritoneales, proliferan y escapan a la vigilancia inmune.
Mientras se cortan de la circulación vascular sistémica, los cortes tumorales contienen componentes celulares y acelulares, incluyendo la matriz extracelular, las células del estroma, las células inmunes, las células cancerosas, las células endoteliales y los nervios. Este microambiente semiintacto permite la investigación funcional de estos tipos de células, lo que es excepcionalmente ventajoso en comparación con los cultivos de organoides 3D, que consisten solo en células cancerosas12. Si bien los cultivos de cortes organotípicos son ventajosos en algunos aspectos, también son inherentemente un enfoque basado en el bajo rendimiento, en comparación con los organoides 3D, que pueden expandirse y son adecuados para el cribado terapéutico de fármacos en investigación multiplexado13,14,15. En el caso de PMP, no ha habido informes que documenten el establecimiento confiable y el paso perpetuo de organoides derivados de PMP16. Esto probablemente se deba a la naturaleza de crecimiento lento de las células tumorales derivadas de PMP, así como al bajo número de células epiteliales malignas que se encuentran dentro de estos tumores mucinosos. Dada la necesidad de desarrollar modelos para estudiar PMP, los cortes organotípicos son especialmente adecuados para estudiar esta enfermedad. Presentamos un protocolo para preparar, obtener imágenes y analizar PMP de especímenes humanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

El pseudomixoma peritonei (PMP) es una afección poco frecuente que resulta de la diseminación de un tumor primario mucinoso y la acumulación resultante de células tumorales secretoras de mucina en la cavidad peritoneal. La PMP puede surgir de varios tipos de cáncer, incluidos el apendicular, el ovárico y el colorrectal, aunque las neoplasias apendiculares son, con mucho, la etiología más común. La PMP es difícil de estudiar debido a su (1) rareza, (2) modelos murinos limitados y (3) histología mucinosa y acelular. El método presentado aquí permite la visualización e interrogación en tiempo real de estos tipos de tumores utilizando cortes organotípicos ex vivo derivados del paciente en una preparación donde el microambiente tumoral (TME) permanece intacto. En este protocolo, primero describimos la preparación de cortes tumorales utilizando un vibratomo y el posterior cultivo a largo plazo. En segundo lugar, describimos imágenes confocales de cortes tumorales y cómo monitorear las lecturas funcionales de viabilidad, imágenes de calcio y proliferación local. En resumen, las rebanadas se cargan con tintes de imagen y se colocan en una cámara de imágenes que se puede montar en un microscopio confocal. Los videos de lapso de tiempo y las imágenes confocales se utilizan para evaluar la viabilidad inicial y la funcionalidad celular. Este procedimiento también explora el movimiento celular traslacional y las interacciones de señalización paracrina en el TME. Por último, describimos un protocolo de disociación para cortes tumorales que se utilizarán para el análisis de citometría de flujo. El análisis cuantitativo de citometría de flujo se puede utilizar para pruebas terapéuticas de banco a cabecera para determinar los cambios que ocurren dentro del paisaje inmune y el contenido de células epiteliales.

En resumen, las muestras de tumores humanos de PMP se obtienen bajo un protocolo aprobado por el IRB. El tejido se prepara, se microdisecciona y se solidifica en un molde de agarosa para ser cortado con un vibratomo (Figura 1A; Video 1). Una vez cortados, los cortes de tejido se colocan y se cultivan en membranas de inserción permeables (Figura 1B), que se pueden utilizar para ensayos de imágenes in situ, así como para interrogación...

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Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Describimos un protocolo para la producción, cultivo y visualización de cánceres humanos, que han hecho metástasis a las superficies peritoneales. Las muestras tumorales resecadas se cortan con un vibratomo y se cultivan en insertos permeables para aumentar la oxigenación y la viabilidad, seguidas de imágenes y análisis posteriores mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

Cultivo e imágenes de cortes tumorales organotípicos ex vivo de pseudomixoma peritonei a partir de muestras tumorales humanas resecadas

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Esta investigación demuestra un enfoque novedoso para el estudio de la terapéutica y la patobiología del cáncer apendicular en un entorno preclínico. Estos métodos pueden ser más ampliamente aplicables al estudio de otras neoplasias malignas. El cáncer de apéndice es difícil de estudiar dada su baja incidencia en ausencia de un apéndice en ratones para el modelado de enfermedades.Esta técnica permite el estudio de las interacciones celulares dentro del microambiente tumoral. Este método se puede aplicar para estudiar la biología de múltiples tipos de cánceres que tienen la propensión a hacer metástasis al epiplón, como los cánceres colorrectal y de ovario. Comience por preparar los medios de transporte y cultura.A la llegada del tejido, transfiera los tejidos tumorales del pseudomixoma peritonei a 35 DMEM completos que contengan seis platos de centímetros de diámetro. Además de eliminar cualquier mucina licuada, o regiones de tejido altamente mucinoso, elimine cualquier tejido que sea difícil de cortar con un bisturí. Cortar los nódulos de tejido tumoral aproximadamente en pedazos cúbicos de un centímetro más pequeños.para la preparación de agarosa y la incrustación de tejidos, prepare una solución al 5% de agarosa de bajo punto de fusión en PBS sin suero bovino fetal o FBS el mismo día si llegan los tejidos. Agregue la solución líquida de agarosa al 5% a los platos de seis centímetros que contienen dos o tres muestras tumorales más pequeñas hasta que cubra la muestra. Coloque los pañuelos incrustados en un refrigerador de cuatro grados centígrados durante 30 minutos.Desmonte las muestras de tejido en el vibratomo, retire la barrena solidificada del refrigerador y corte los cubos de agarosa ligeramente más grandes que el ancho del tejido con un bisturí. Aplique súper pegamento a la etapa de vibratomo y coloque suavemente el cubo de agarosa sobre el súper pegamento durante uno o dos minutos para la fijación. Fije la cuchilla al vibratomo y ajuste el grosor de la sección de tejido a aproximadamente 150 a 250 micras para obtener imágenes aguas abajo óptimas.Para cultivar las rodajas de tejido, prepare una placa de inserción permeable agregando dos mililitros de medios DMEM completos por encima de la membrana permeable y tres mililitros por debajo de la membrana permeable. A continuación, levante suavemente las rodajas de tejido de la cámara de corte del vibratomo con un pincel delgado y coloque de dos a cuatro rodajas en platos de cultivo permeables que contengan DMEM completo. Cultive las rodajas durante un máximo de siete días a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%.Durante el reemplazo de medios, cada 24 horas, agregue bortezomib como controles para la destrucción celular y quimioterapias comprobables con 5-fluorouracilo, o 5-FU, a los medios de cultivo para realizar la intervención farmacológica. Coloque cortes tumorales para el análisis de imágenes confocales en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos que contenga PBS con 1% de FBS. Para experimentos de imágenes de calcio, en lugar de PBS, incubar las rodajas en una solución de calcio extracelular.Manchar muestras con tintes de imagen para determinar la viabilidad de los cortes de tejido. Incubar durante 10 minutos a una hora después de agregar el tinte de viabilidad. Después de la incubación, transfiera las rodajas a una placa de Petri con fondo de vidrio ópticamente transparente que contenga PBS con 1% de FBS para ser utilizada para obtener imágenes en un dispositivo de imágenes confocales.Corte una pieza pequeña del extremo de una punta de pipeta de un mililitro para ensanchar la abertura, permitiendo una disociación mecánica vigorosa por pipeteo. Incubar rodajas a 37 grados centígrados con rotación durante cinco a 15 minutos en un mililitro de tampón de digestión, con una alteración vigorosa del tejido de dos a tres veces durante la incubación mediante disociación mecánica. Una vez que se digiere el tejido, transfiera el tejido interrumpido con medios de digestión en un filtro de 70 micrómetros colocado encima de un tubo cónico de 50 mililitros.Escoja piezas más grandes con pinzas estériles o una pipeta. Usando el extremo posterior romo de una jeringa de plástico de cinco mililitros, triture las rodajas no disociadas más grandes y lávelas con cuatro mililitros de PBS que contengan 2% de FBS. Tome el sobrenadante de células disociadas y centrifugar a 300 G durante cinco a 10 minutos.Retire el sobrenadante y lave el pellet con un mililitro de PBS que contenga 2% de FBS. Para preparar la muestra para la citometría de flujo, agregue el tampón de bloqueo que contiene 50 microlitros de bloque FC humano e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Realizar tinción extracelular utilizando los anticuerpos respectivos en 50 microlitros de PBS que contienen 2% de FBS.Alícuota cinco mililitros de medio completo para condiciones de control y tratamiento. En las dos a cuatro rebanadas emplatadas en los platos permeables, agregue los medios de las alícuotas de tratamiento de control y las terapias combinadas adicionales que se utilizarán para la viabilidad posterior, el análisis de muertos vivos. Deje las rodajas de tejido en un cultivo que contenga DMEM completo durante dos a cinco días, cambiando los medios, así como bortezomib y 5-FU cada dos días.Para el análisis de viabilidad luminiscente, agregue 500 microlitros de PBS en un plato de 12 pocillos y transfiera las rodajas de tejido secuencialmente emparejadas a la solución de PBS usando un pincel o una pipeta de un mililitro. Retire el PBS de las rodajas. Agregue 500 microlitros de la solución de viabilidad luminiscente por condición e incube con una rotación lenta en el agitador a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de leer la luminiscencia utilizando un lector de placas de luminiscencia.La tinción de mucina en cortes de tejido se visualizó utilizando tinción periódica de cambio ácido y anticuerpos específicos de mucina. La incubación en calceína AM y yoduro de propidio determinó la salud y viabilidad. Los núcleos se superpusieron a las células que proliferaron durante el cultivo.Estos resultados se cuantificaron para determinar el número de células proliferantes dentro del corte tumoral. Las rebanadas incubadas en el anticuerpo conjugado CD11b PE y Fluo-4 AM, marcaron las células inmunes locales en CTU. Las imágenes a escala de pseudocolor que muestran los niveles de calcio intracelular permitieron visualizar niveles diferenciales de calcio intracelular.Aquí se muestra la actividad espontánea rastreada y el tiempo transcurrido antes, durante y después de la respuesta intercelular al calcio dentro de la célula inmune CD11b positiva resaltada. Se cuantificaron los rastros crudos de respuestas de calcio en la célula inmune CD11b, junto con otras células sensibles y no sensibles. Aquí se muestran resultados representativos del inmunotipado de una muestra tumoral de paciente con pseudomixoma peritonei.La cuantificación del perfil inmunológico tumoral mostró que la muestra 337 del donante tiene altos niveles de macrófagos M2, lo que indica que la utilización de cortes de tejido derivados del pseudomixoma peritonei permitió interrogar el paisaje celular único del donante de las muestras tumorales del paciente. El farmacotipado y el análisis posterior de cortes de tejido de tejidos humanos pseudomixoma peritonei mostraron la destrucción de células en cortes tumorales confirmada por el análisis de citotoxicidad y las imágenes confocales de túnel. En respuesta al fármaco citotóxico, bortezomib y 5-fluorouracilo.El análisis de viabilidad luminiscente se realizó utilizando cortes emparejados secuencialmente. La producción exitosa de cortes de tumores mucinosos requiere una disección meticulosa y la eliminación de componentes de tejido celular y acelular como la grasa y el tejido denso de la pared abdominal. Esta técnica puede permitir modelar interacciones entre las células cancerosas y múltiples tipos de células en el microambiente tumoral, como las interacciones de células adiposas, vasculares e inmunes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Modelo In Vivo para Pruebas Efecto de la hipoxia sobre la metástasis tumoral

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

En Vivo EPR evaluación de pH, pO2, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Gen reportero de radionúclido-fluorescencia de imagen para seguir la progresión del Tumor en modelos de roedores Tumor

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital de la reacción en cadena de polimerasa para la variación genética en un paciente de la poliposis adenomatosa familiar esporádico con el formato de Chip en tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...