Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Författarna vill tacka Kersi Pestonjamasp från Moores Cancer Center imaging core facility för hjälp med mikroskopen UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Detta arbete stöddes dessutom av ett JoVE-publikationsbidrag (JRW), samt generösa gåvor från dödsboet efter Elisabeth och Ad Creemers, Euske Family Foundation, Gastrointestinal Cancer Research Fund och Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).

Avidentifiering och förvärv av alla vävnader utfördes enligt ett IRB-godkänt protokoll vid University of California, San Diego.
1. Beredning av humana PMP-vävnader för vävnadsbearbetning och odling
<ol><li>Transport av tumörvävnader och mikrodissektion<ol><li>Förbered transport- och odlingsmedia: komplett 10% (v / v) Dulbeccos modifierade örnmedia (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (Pen Strep).</li>
		<li>Vid vävnadens ankomst och enl...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).</li><li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture.">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li><li>Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+mouse+models+of+pseudomyxoma+peritonei+recapitulate+the+human+inflammatory+tumor+microenvironment.">Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment.">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

Detta manuskript beskriver en teknik som kan användas för att odla, förhöra och analysera humana pseudomyxoma peritonei (PMP) tumörprover. Vi har använt många nedströms funktionella analyser för att förhöra tumörens immunmikromiljö och en plattform för bänk-till-säng-testning.
Medan metoden är mycket effektiv i våra händer, kommer det att kräva viss övning att skära tumörprover med hjälp av en vibratom. Vi stötte nämligen på problem som berodde på mycket mucinösa p...

Pseudomyxoma peritonei (PMP) är sällsynt syndrom med en incidens på 1 per miljon människor per år1. De flesta PMP-fall orsakas av metastaser från appendiceala neoplasmer. Med tanke på att möss inte har en människoliknande bilaga är modellering av denna typ av cancer fortfarande extremt utmanande. Medan den primära sjukdomen ofta kan botas genom kirurgisk resektion, är behandlingsalternativen för metastatisk sjukdom begränsade. Därför är motiveringen för att utveckla denna nya organotypiska skivmodell att studera patobiologin hos PMP. Hittills finns det inga appendiceala organoidmodeller som kan odlas ständigt; En ny modell visade sig dock vara användbar för farmakologisk testning av terapeutiska medel och immunterapi2. Som sådan har vi anpassat ett organotypiskt skivkultursystem, som har använts i andra typer av mänskliga cancerformer, såsom hjärna, bröst, bukspottkörtel, lunga, äggstockar och andra 3,4,5,6.
Förutom appendiceala neoplasmer resulterar PMP ibland från andra tumörtyper, inklusive äggstockscancer7, och i sällsynta fall intraduktala papillära mucinösa neoplasmer8 och tjocktarmscancer9. Dessutom tenderar dessa tumörer att växa långsamt, med dåliga transplantathastigheter i patient-derived xenograft (PDX) modeller10,11. Med tanke på dessa utmaningar finns det ett ouppfyllt behov av att utveckla modeller för att studera denna sjukdom för att börja förstå patobiologin hos PMP och hur dessa cancerceller rekryteras till bukhinnans ytor, förökar sig och undgår immunövervakning.
Medan de skärs från den systemiska vaskulära cirkulationen innehåller tumörskivor cellulära och acellulära komponenter, inklusive den extracellulära matrisen, stromaceller, immunceller, cancerceller, endotelceller och nerver. Denna halvintakta mikromiljö möjliggör funktionell undersökning av dessa celltyper, vilket är unikt fördelaktigt jämfört med 3D-organoidkulturer, som endast består av cancerceller12. Medan organotypiska skivkulturer är fördelaktiga i vissa avseenden, är de också i sig ett lågkapacitetsbaserat tillvägagångssätt jämfört med 3D-organoider, som kan utökas och är lämpliga för multiplex terapeutisk läkemedelsscreening13,14,15. När det gäller PMP har det inte förekommit några rapporter som dokumenterar tillförlitlig etablering och evig passage av PMP-härledda organoider16. Detta beror sannolikt på den långsamt växande karaktären hos PMP-härledda tumörceller, liksom det låga antalet maligna epitelceller som finns i dessa mucinösa tumörer. Med tanke på behovet av att utveckla modeller för att studera PMP är organotypiska skivor unikt lämpade för att studera denna sjukdom. Vi presenterar ett protokoll för att förbereda, avbilda och analysera PMP från mänskliga prover.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

Pseudomyxoma peritonei (PMP) är ett sällsynt tillstånd som härrör från spridningen av en mucinös primärtumör och den resulterande ackumuleringen av mucinutsöndrande tumörceller i bukhålan. PMP kan uppstå från olika typer av cancer, inklusive appendiceal, ovarian och kolorektal, även om appendiceal neoplasmer är den överlägset vanligaste etiologin. PMP är utmanande att studera på grund av dess (1) sällsynthet, (2) begränsade murina modeller och (3) mucinös, acellulär histologi. Metoden som presenteras här möjliggör visualisering och förhör i realtid av dessa tumörtyper med hjälp av patienthärledda ex vivo organotypiska skivor i ett preparat där tumörmikromiljön (TME) förblir intakt. I detta protokoll beskriver vi först beredningen av tumörskivor med användning av en vibratom och efterföljande långsiktig kultur. För det andra beskriver vi konfokal avbildning av tumörskivor och hur man övervakar funktionella avläsningar av livskraft, kalciumavbildning och lokal spridning. Kort sagt, skivor laddas med bildfärger och placeras i en bildkammare som kan monteras på ett konfokalmikroskop. Timelapse-videor och konfokala bilder används för att bedöma den ursprungliga livskraften och cellulära funktioner. Denna procedur undersöker också translationella cellulära rörelser och parakrina signalinteraktioner i TME. Slutligen beskriver vi ett dissociationsprotokoll för tumörskivor som ska användas för flödescytometrianalys. Kvantitativ flödescytometrianalys kan användas för terapeutisk testning från bänk till säng för att bestämma förändringar som sker inom immunlandskapet och epitelcellinnehållet.

Kort sagt, humana tumörprover från PMP erhålls under ett IRB-godkänt protokoll. Vävnaden bereds, mikrodissekeras och stelnar i en agarosform för att skäras med hjälp av en vibratom (figur 1A; Videoklipp 1). När vävnadsskivorna har skurits placeras de och odlas på permeabla insatsmembran (figur 1B), som kan användas för avbildningsanalyser in situ, såväl som för cellulära och funktionella förhör med flödescytometri, k...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Vi beskriver ett protokoll för produktion, odling och visualisering av mänskliga cancerformer, som har metastaserat till peritoneala ytor. Resekterade tumörprover skärs med hjälp av en vibratom och odlas på permeabla insatser för ökad syresättning och livskraft, följt av avbildning och nedströmsanalyser med konfokalmikroskopi och flödescytometri.

Odling och avbildning av ex vivo organotypiska pseudomyxoma peritonei tumörskivor från resekterade humana tumörprover

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Denna forskning visar ett nytt tillvägagångssätt för studier av appendiceal cancerterapi och patobiologi i en preklinisk miljö. Dessa metoder kan vara mer allmänt tillämpliga på studier av andra maligniteter. Appendiceal cancer är svår att studera med tanke på dess låga förekomst i frånvaro av en bilaga hos möss för sjukdomsmodellering.Denna teknik möjliggör studier av cellinteraktioner inom tumörmikromiljön. Denna metod kan tillämpas för att studera biologin hos flera typer av cancer som har benägenhet att metastasera till omentum, såsom kolorektal och äggstockscancer. Börja med att förbereda transport- och kulturmedia.Vid vävnadsankomst, överför pseudomyxom peritonei-tumörvävnaderna till 35 kompletta DMEM innehållande rätter med sex centimeter diameter. Förutom att ta bort flytande mucin eller mycket mucinösa vävnadsområden, ta bort all vävnad som är svår att skära med en skalpell. Skär tumörvävnadsknölar grovt i en kubcentimeter mindre bitar.För agarosberedning och vävnadsinbäddning, förbered en 5% lösning av smält agaros i PBS utan fetalt bovint serum eller FBS samma dag om vävnad anländer. Tillsätt den flytande 5%agaroslösningen till de sex centimeter skålarna som innehåller två till tre mindre tumörprover tills den täcker provet. Placera de inbäddade vävnaderna i ett kylskåp med fyra grader Celsius i 30 minuter.Demontera vävnadsproverna på vibratomet, ta bort den stelnade skruven från kylskåpet och skär agaroskuberna något större än vävnadens bredd med en skalpell. Applicera superlim på vibratomestadiet och placera försiktigt agaroskuben på superlimet i en till två minuter för fixering. Fäst bladet på vibratomen och ställ in tjockleken på vävnadssektionen till ungefär 150 till 250 mikron för optimal avbildning nedströms.För att odla vävnadsskivorna, förbered en permeabel insatsplatta genom att tillsätta två milliliter komplett DMEM-media ovanför det permeabla membranet och tre milliliter under det permeabla membranet. Lyft sedan försiktigt vävnadsskivorna ur vibratomens skärkammare med en tunn pensel och placera två till fyra skivor i permeabla odlingsskålar som innehåller komplett DMEM. Odla skivorna i upp till sju dagar vid 37 grader Celsius i 5% koldioxid.Vid byte av media tillsätts bortezomib var 24:e timme som kontroller för celldödande och testbara kemoterapier 5-Fluorouracil eller 5-FU till odlingsmediet för farmakologisk intervention. Placera tumörskivor för konfokal bildanalys i en enda brunn i en 12-brunnskål innehållande PBS med 1% FBS. För kalciumavbildningsexperiment, istället för PBS, inkubera skivorna i en extra cellulär kalciumlösning.Färgprover med bildfärger för att bestämma livskraften hos vävnadsskivor. Inkubera i 10 minuter till en timme efter tillsats av livskraftsfärgämnet. Efter inkubation, överför skivorna till en optiskt klar petriskål med glasbotten som innehåller PBS med 1% FBS som ska användas för avbildning på en konfokal bildanordning.Skär en liten bit från änden av en en milliliter pipettspets för att bredda öppningen, vilket möjliggör kraftig mekanisk dissociation genom pipettering. Inkubera skivor vid 37 grader Celsius med rotation i fem till 15 minuter i en milliliter matsmältningsbuffert, med kraftig vävnadsstörning två till tre gånger under inkubation med mekanisk dissociation. När vävnaden har smälts, överför den störda vävnaden med matsmältningsmedia på ett 70 mikrometer filter placerat ovanpå ett 50 ml koniskt rör.Plocka större bitar med sterila pincett eller pipett. Använd den trubbiga baksidan av en plastspruta på fem milliliter, mosa alla större oisolerade skivor och tvätta dem med fyra milliliter PBS innehållande 2% FBS. Ta den dissocierade cellsupernatanten och centrifugera vid 300 G i fem till 10 minuter.Ta bort supernatanten och tvätta pelleten med en milliliter PBS innehållande 2% FBS. För att bereda provet för flödescytometri, tillsätt den blockerande bufferten innehållande 50 mikroliter humant FC-block och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Utför extra cellulär färgning med respektive antikroppar i 50 mikroliter PBS innehållande 2% FBS.Alikvot fem milliliter kompletta medier för kontroll- och behandlingsförhållanden. På de två till fyra skivor som pläterats på de permeabla skålarna, tillsätt media från kontrollbehandlingsalikvoterna och de ytterligare kombinationsterapier som ska användas för nedströms livskraft, levande död analys. Lämna vävnadsskivor i en kultur som innehåller komplett DMEM i två till fem dagar, byt media samt bortezomib och 5-FU varannan dag.För analys av luminescerande livskraft, tillsätt 500 mikroliter PBS i en 12-brunnsskål och överför de sekventiellt matchade vävnadsskivorna till PBS-lösningen med en pensel eller en milliliter pipett. Ta bort PBS från segmenten. Tillsätt 500 mikroliter av lösningen med luminescens per tillstånd och inkubera långsamt på skakapparaten vid rumstemperatur i 30 minuter innan luminiscensen avläses med hjälp av en läsare av luminiscensplattor.Mucinfärgningen i vävnadsskivor visualiserades med hjälp av periodisk syraskiftfärgning och mucinspecifika antikroppar. Inkubation i calcein AM och propidiumjodid bestämde hälsa och livskraft. Kärnorna överlappade cellerna prolifererade under odling.Dessa resultat kvantifierades för att bestämma antalet prolifererande celler inom tumörskivan. Skivorna inkuberade i CD11b PE-konjugerad antikropp och Fluo-4 AM, märkte de lokala immuncellerna i CTU. Pseudofärgskalade bilder som visar intracellulära kalciumnivåer möjliggjorde visualisering av differentiella nivåer av intracellulärt kalcium.Spontan aktivitet spårad och tidsfördröjning före, under och efter intercellulärt kalciumsvar inom den markerade CD11b-positiva immuncellen visas här. De råa spåren av kalciumsvar i CD11b-immuncellen, tillsammans med andra responsiva och icke-responsiva celler kvantifierades. Representativa resultat av immunotypning av ett patienttumörprov med pseudomyxoma peritonei visas här.Kvantifiering av tumörimmunprofilen visade att donatorprovet 337 har höga nivåer av M2-makrofager, vilket indikerar att användning av pseudomyxom peritonei-härledda vävnadsskivor möjliggjorde förhör av det unika donatorcellulära landskapet hos patientens tumörprover. Farmakotypning och nedströmsanalys av vävnadsskivor från pseudomyxoma peritonei mänskliga vävnader visade dödande av celler i tumörskivor, vilket bekräftades av cytotoxicitetsanalys och tunnelkonfokal avbildning. Som svar på det cytotoxiska läkemedlet, bortezomib och 5-fluorouracil.Självlysande viabilitetsanalys utfördes med sekventiellt matchade skivor. Framgångsrik produktion av skivor från mucinösa tumörer kräver noggrann dissektion och avlägsnande av cellulära och acellulära vävnadskomponenter som fett och tät bukväggsvävnad. Denna teknik kan möjliggöra modellering av interaktioner mellan cancerceller och flera celltyper i tumörmikromiljön, såsom fett-, kärl- och immuncellsinteraktioner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In vivo modell för att testa effekten av hypoxi på tumörmetastas

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatta CD8 T-lymfocyter i Human Lung tumör skivor med konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel och snabb metod att få hög kvalitet tumör DNA från klinisk-patologiska exemplar med Touch avtryck cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklid-fluorescens Reporter gen Imaging för att spåra tumör Progression i gnagare tumör modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitala polymeras Chain Reaction Assay för den genetiska variationen i en sporadisk familjär adenomatös polypos Patient med formatet Chip-i-ett-rör

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus för tumör-riktade immunmodulering: Design och utvärdering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo avbildning och kvantifiering av värdens angiogena respons i Zebrafish Tumörxenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En ny Stromal Fibroblast-Modulerad 3D Tumör Spheroid modell för att studera tumör-Stroma interaktion och drug discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...