Denne forskningen demonstrerer en ny tilnærming til studiet av blindtarmskreftbehandling og patobiologi i en preklinisk setting. Disse metodene kan være mer anvendelige for studiet av andre maligniteter. Appendikeal kreft er vanskelig å studere gitt sin lave forekomst i fravær av et vedlegg hos mus for sykdomsmodellering.
Denne teknikken tillater studier av celleinteraksjoner i tumormikromiljøet. Denne metoden kan brukes til å studere biologien til flere typer kreft som har tilbøyelighet til å metastasere til omentumet, for eksempel kolorektal og eggstokkreft. Begynn med å forberede transport- og kulturmediene.
Ved vevets ankomst, overfør pseudomyxoma peritonei tumorvev til 35 komplette DMEM som inneholder seks centimeter diameter retter. I tillegg til å fjerne flytende mucin, eller svært mucinøse vevsregioner, fjern vev som er vanskelig å kutte med en skalpell. Skjær svulstvevsknuter omtrent i en kube centimeter mindre biter.
for agarosepreparasjon og vevsinnbygging, lag en 5% løsning av lavsmelteagarose i PBS uten føtalt bovint serum eller FBS samme dag hvis vev ankommer. Tilsett den flytende 5% agaroseløsningen til de seks centimeter store rettene som inneholder to til tre mindre tumorprøver til den dekker prøven. Plasser det innebygde vevet i et fire graders Celsius-kjøleskap i 30 minutter.
Demonter vevsprøvene på vibratomen, fjern den størknede skruen fra kjøleskapet, og kutt agarosebitene litt større enn bredden på vevet ved hjelp av en skalpell. Påfør superlim på vibratome-trinnet og legg agarosekuben forsiktig på superlimet i ett til to minutter for festing. Fest bladet til vibratomet, og sett tykkelsen på vevsseksjonen til omtrent 150 til 250 mikron for optimal nedstrøms avbildning.
For å dyrke vevskivene, lag en permeabel innsatsplate ved å tilsette to milliliter komplett DMEM-medium over den permeable membranen og tre milliliter under den permeable membranen. Løft deretter vevskivene forsiktig ut av vibratomens skjærekammer med en tynn pensel, og legg to til fire skiver i permeable kulturretter som inneholder komplett DMEM. Dyrk skivene i opptil syv dager ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid.
Under medieutskifting, hver 24. time, legg til bortezomib som kontroller for celledreping, og testbare kjemoterapier 5-Fluorouracil, eller 5-FU, til kulturmediet for å utføre farmakologisk intervensjon. Plasser tumorskiver for konfokal bildeanalyse i en enkelt brønn i en 12-brønns tallerken som inneholder PBS med 1% FBS. For kalsiumavbildningseksperimenter, i stedet for PBS, inkuber skivene i en ekstra cellulær kalsiumløsning.
Flekkprøver med bildebehandlingsfarger for å bestemme levedyktigheten til vevskiver. Inkuber i 10 minutter til en time etter tilsetning av levedyktighetsfargestoffet. Etter inkubering, overfør skivene til en optisk klar glassbunn petriskål som inneholder PBS med 1% FBS som skal brukes til avbildning på en konfokal bildebehandlingsenhet.
Klipp et lite stykke fra enden av en milliliter pipettespiss for å utvide åpningen, slik at kraftig mekanisk dissosiasjon ved pipettering. Inkuber skiver ved 37 grader Celsius med rotasjon i fem til 15 minutter i en milliliter fordøyelsesbuffer, med kraftig vevsforstyrrelse to til tre ganger under inkubering ved bruk av mekanisk dissosiasjon. Når vevet er fordøyd, overfør det forstyrrede vevet med fordøyelsesmediet på et 70 mikrometer filter plassert på toppen av et 50 milliliter konisk rør.
Plukk større biter med steril tang eller pipette. Bruk den stumpe bakenden av en plast fem milliliter sprøyte, mos eventuelle større udissosierte skiver og vask dem med fire milliliter PBS som inneholder 2% FBS. Ta den dissosierte cellesupernatanten og sentrifugen ved 300G i fem til 10 minutter.
Fjern supernatanten og vask pelleten med en milliliter PBS inneholdende 2% FBS. For å klargjøre prøven for flowcytometri, tilsett blokkeringsbufferen som inneholder 50 mikroliter human FC-blokk, og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter. Utfør ekstra cellulær farging ved hjelp av de respektive antistoffene i 50 mikroliter PBS inneholdende 2% FBS.
Aliquot fem milliliter komplette medier for kontroll- og behandlingsbetingelser. På de to til fire skivene som er belagt på de permeable tallerkenene, legger du til media fra kontrollbehandlingsalikotene og de ekstra kombinasjonsterapiene som skal brukes til levedyktighet nedstrøms, levende død analyse. La vevsskiver ligge i en kultur som inneholder komplett DMEM i to til fem dager, skifte media også bortezomib og 5-FU annenhver dag.
For luminescerende levedyktighetsanalyse, tilsett 500 mikroliter PBS i en 12-brønnsfat, og overfør de sekvensielt matchede vevsskivene til PBS-løsningen ved hjelp av en pensel eller en milliliter pipette. Fjern PBS fra stykkene. Tilsett 500 mikroliter av den selvlysende levedyktighetsløsningen per tilstand og inkuber med en langsom rotasjon på shakeren ved romtemperatur i 30 minutter før du leser luminescensen ved hjelp av en luminescensplateleser.
Mucinfargingen i vevsskiver ble visualisert ved hjelp av periodisk syreskiftfarging og mucinspesifikke antistoffer. Inkubasjon i kalcein AM og propidiumjodid bestemte helse og levedyktighet. Kjernene overlappet cellene som ble proliferert under kultur.
Disse resultatene ble kvantifisert for å bestemme antall prolifererende celler i tumorskiven. Skivene inkubert i CD11b PE konjugert antistoff og Fluo-4 AM, merket de lokale immuncellene i CTU. Pseudocolor skalerte bilder som viser intracellulære kalsiumnivåer tillot visualisering av differensielle nivåer av intracellulært kalsium.
Sporbar spontan aktivitet og bortfalt tid før, under og etter intercellulær kalsiumrespons i den markerte CD11b-positive immuncellen er vist her. De rå sporene av kalsiumresponser i CD11b immuncellen, sammen med andre responsive og ikke-responsive celler ble kvantifisert. Representative resultater av immuntyping av en pasienttumorprøve med pseudomyxoma peritonei er vist her.
Kvantifisering av tumorimmunprofilen viste at donorprøven 337 har høye nivåer av M2-makrofager, noe som indikerer at bruk av pseudomyxoma peritonei-avledede vevsskiver tillot avhør av det unike donorcellulære landskapet til pasientens tumorprøver. Farmakotyping og nedstrømsanalyse av vevsskiver fra pseudomyxoma peritonei humant vev viste drap av celler i tumorskiver som bekreftet ved cytotoksisitetsanalyse og tunnelkonfokal avbildning. Som respons på det cytotoksiske legemidlet, bortezomib og 5-fluorouracil.
Luminescerende levedyktighetsanalyse ble utført ved bruk av sekvensielt matchede skiver. Vellykket produksjon av skiver fra mucinøse svulster krever grundig disseksjon og fjerning av cellulære og acellulære vevskomponenter som fett og tett bukveggvev. Denne teknikken kan tillate modellering av interaksjoner mellom kreftceller og flere celletyper i tumormikromiljøet, for eksempel fett-, vaskulære og immuncelleinteraksjoner.