Name: generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging
Uploaded: 2022-11-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af finansiering fra METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation og NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Vi anerkender hjælpen fra University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, en delt ressource på Simmons Comprehensive Cancer Center, som delvist støttes af National Cancer Institute under tildelingsnummer P30 CA142543. Særlig tak til alle medlemmer af Chan Lab.

Alt musevæv, der anvendes i dette manuskript, er blevet etisk indsamlet i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) regler og retningslinjer fra University of Texas Southwestern Medical Center. Ligeledes samtykkede alle patienterne forud for vævsdonation under tilsyn af et Institutional Review Board (IRB), og prøverne blev afidentificeret.
BEMÆRK: Denne protokol beskriver dannelsen af organoider fra primært væv.
1. Forbered...

<ol>
	<li>Ghandi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia.">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li><li>Roarty, K., Echeverria, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+models+for+investigating+breast+cancer+therapy+resistance+and+metastasis.">Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+New+dimensions.">Hallmarks of cancer: New dimensions.</a> Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biological+principles+of+metastasis.">Emerging biological principles of metastasis.</a> Cell. 168 (4), 670-691 (2017).</li><li>Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+organoids+for+cancer+biology+and+precision+medicine.">Applications of organoids for cancer biology and precision medicine.</a> Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Tuveson, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+modeling+meets+human+organoid+technology.">Cancer modeling meets human organoid technology.</a> Science. 364 (6444), 952-955 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorectal+tumor+organoid+library+demonstrates+progressive+loss+of+niche+factor+requirements+during+tumorigenesis.">A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+lung+cancer+organoids+as+in+vitro+cancer+models+for+therapeutic+screening.">Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening.</a> Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity.">A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Wrenn, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collective+metastasis+by+nanolumenal+signaling.">Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling.</a> Cell. 183 (2), 395-410 (2020).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+predict+chemoradiation+responses+of+locally+advanced+rectal+cancer.">Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).</li><li>Yao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pancreas+tumor+derived+organoid+study:+from+drug+screen+to+precision+medicine.">A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Chan, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+educate+natural+killer+cells+to+a+metastasis-promoting+cell+state.">Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state.</a> Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).</li><li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+co-culture+methods+to+capture+cancer+cell-natural+killer+cell+interactions.">Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).</li><li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+role+of+natural+killer+cells+in+cancer+metastasis.">The changing role of natural killer cells in cancer metastasis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+cancer+organoids.">Next-generation cancer organoids.</a> Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Padmanaban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+assays+for+murine+and+human+primary+and+metastatic-site+tumors.">Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors.</a> Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).</li></ol>

Forskellige metoder er blevet beskrevet i litteraturen til at generere tumororganoider. Denne protokol fremhæver en metode til generering af tumororganoider direkte fra tumoren uden at passere. Ved hjælp af denne metode kan tumororganoider produceres inden for få timer efter initiering af proceduren og genererer tæt på 100% levedygtige organoider sammenlignet med 70% rapporteret i litteraturen31. Til sammenligning kræver andre metoder seriel passaging af celler i organoider over flere uger. ...

Evnen til at modellere epitelceller in vitro har været grundlaget for moderne biomedicinsk forskning, fordi den fanger cellulære funktioner, der ikke er tilgængelige in vivo. For eksempel kan voksende epitelcellelinjer i et todimensionelt plan give en vurdering af de molekylære ændringer, der opstår i en epitelcelle under proliferation1. Desuden er måling af den dynamiske regulering mellem signalering og genekspression begrænset i in vivo-systemer 2. I kræftforskning har kræftepitelcellelinjemodellering muliggjort identifikation af molekylære drivkræfter for sygdomsprogression og potentielle lægemiddelmål3. Imidlertid har voksende kræftepitelcellelinjer på et todimensionelt plan begrænsninger, da de fleste er genetisk udødeliggjort og modificeret, ofte klonale, udvalgt for deres evne til at vokse under ikke-fysiologiske forhold, begrænset i deres vurdering af tredimensionel (3D) tumorvævsarkitektur og ikke tilstrækkeligt modellere mikromiljøinteraktioner inden for et realistisk vævsmiljø4. Disse begrænsninger er især tydelige i modellering af metastaser, som in vivo inkluderer flere forskellige biologiske stadier, herunder invasion, spredning, cirkulation og kolonisering på det fjerne organsted5.
Cancer epitelorganoider er udviklet til bedre at rekapitulere 3D-miljøet og opførsel af tumorer 6,7,8. Organoider blev først udviklet fra enkelte LRG5+ tarmkryptceller og differentieret til at repræsentere 3D-strukturen af krypt-villus-enheder, der opretholdt tyndtarmens hierarkiske struktur in vitro9. Denne tilgang tillod visualisering og karakterisering i realtid af selvorganiserende vævsarkitektur under homeostatiske og stressforhold. Som en naturlig forlængelse blev kræftepitelorganoider udviklet til at modellere mange forskellige kræfttyper, herunder kolorektal 10, bugspytkirtel11, bryst12, lever13, lunge 14, hjerne 15 og gastrisk kræft 16. Kræftepitelorganoider er blevet udnyttet til at karakterisere kræftudvikling17,18 og metastatisk spatiotemporal adfærd 19,20 og forhøre tumorheterogenitet 21 og teste kemoterapier22. Kræftepitelorganoider er også blevet isoleret og indsamlet under igangværende kliniske forsøg for at forudsige patientens respons på kræftmidler og strålebehandling ex vivo 8,23,24,25. Desuden kan systemer, der inkorporerer kræftepitelorganoider, kombineres med andre ikke-kræftceller, såsom immunceller, for at danne en mere omfattende model af tumormikromiljøet for at visualisere interaktioner i realtid, afdække, hvordan kræftepitelceller ændrer den grundlæggende karakter af cytotoksiske effektorimmunceller såsom naturlige dræberceller og teste potentielle immunterapier og antistofafhængig cytotoksisk aktivitet26, 27,28. Denne artikel demonstrerer en metode til generering af epitelorganoider uden passage og indlejring i kollagen og kælder ekstracellulær matrix (ECM). Derudover deles teknikker til nedstrøms billeddannelse af isolerede organoider også.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM HEPES Buffer</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Glutamax</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DMEM</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL/0.2 &#181;m filter flask</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>#564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Solution (32%)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Independent Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6546</td>
			<td>Common basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#10565-018</td>
			<td>Basal cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8662</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>#354230</td>
			<td>Basement Extracellular Matrix (BECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 N)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>SH3002701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging

Organoider er en pålidelig metode til modellering af organvæv på grund af deres selvorganiserende egenskaber og tilbageholdelse af funktion og arkitektur efter formering fra primært væv eller stamceller. Denne metode til organoidgenerering giver afkald på enkeltcelledifferentiering gennem flere passager og bruger i stedet differentiel centrifugering til at isolere brystepitelorganoider fra mekanisk og enzymatisk dissocieret væv. Denne protokol giver en strømlinet teknik til hurtigt at producere små og store epitelorganoider fra både muse- og humant brystvæv ud over teknikker til organoidindlejring i kollagen og kælder ekstracellulær matrix. Desuden gives instruktioner til in-gel-fiksering og immunofluorescerende farvning med det formål at visualisere organoidmorfologi og densitet. Disse metoder er velegnede til utallige downstream-analyser, såsom co-kultivering med immunceller og ex vivo-metastasemodellering via kollageninvasionsassay. Disse analyser tjener til bedre at belyse celle-celleadfærd og skabe en mere fuldstændig forståelse af interaktioner inden for tumormikromiljøet.

Billederne i figur 1 giver et eksempel på vildtype- og tumorholdige brystepitelorganoider fra menneske- og musevæv. Et hurtigt overblik over metoden til isolering af epitelorganoider gennem differentiel centrifugering findes i tegneseriearbejdsgangen i figur 1A, der viser, at primære væv fra forskellige arter kan behandles på næsten identiske måder, mens det giver epitelvæv som vist på brightfield-billederne (figur 1B ). De...

Watch this Scientific Journal Video about Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging at JoVE.com

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Denne protokol diskuterer en tilgang til generering af epitelorganoider fra primær normal og tumorbrystvæv gennem differentiel centrifugering. Desuden er instruktioner inkluderet til tredimensionel dyrkning samt immunofluorescerende billeddannelse af indlejrede organoider.

Generering og billeddannelse af muse- og humane epitelorganoider fra normalt væv og tumorbrystvæv uden passage

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Denne protokol er signifikant for produktionen af hukommelsesepitelorganoider, der genereres uden passage. Den største fordel ved denne teknik er, at organoider kan isoleres fra bryst- og hukommelsesvæv til mennesker og mus efter enzymatisk fordøjelse. Vi udfører en række differentielle centrifugeringstrin, der isolerer epitelorganoider uden at skulle passere celler.En person, der udfører denne teknik, kan stå over for udfordringer, når vævene indlejres i kollagen eller matrix og pletteres i en 96-brøndplade. Desuden er brug af korrekt polymeriseret kollagen og plettering af stabile kupler nøglen til at se invasion. Til at begynde med skal du samle brystvævet fra en euthaniseret mus ved at spille muselemmer og bruge fire 19 gauge nåle, fastgør musen ved poterne til et bræt dækket med en absorberende pude med den ventrale side opad.Spray med 70% ethanol for at glatte pelsen ned og desinficere huden og tørre afføring væk med en gazebind eller serviet. Start lige over det anogenitale område, skær opad fra midterlinjen ved hjælp af kirurgisk saks, pas på ikke at gennembore gennem bughinden. Når du når hagen, skal du lave laterale snit ned ad begge kraveben og ned ad bagbenene og fastgøre musens hud stram til brættet for at udsætte brystfedtpuder.Efter at have lokaliseret de lyske- og thoraxbrystfedtpuder på vildtypemus, skal du bruge tang til at hæve brystfedtpuden. Brug den stumpe ende af skarp stump saks til at oprette en lomme under brystfedtpuden væk fra huden og skære brystfedtpuden væk i et komplet stykke. Når brystfedtpuder er fjernet, skylles PBS i, inden de placeres i en steril vævskulturskål og derefter hurtigt overføres til en vævskulturhætte.Hak brysttumorerne med en nummer 10 eller nummer 11 skalpel for at løsne væv, indtil den når en pastalignende konsistens. Overfør hakket væv til et konisk rør indeholdende 10 til 30 ml kollagenaseopløsning ved hjælp af en skalpel. For at sikre, at alt væv opsamles, pipetteres en milliliter kollagenaseopløsning på vævskulturpladen og tilbage i det koniske rør.Placer det koniske rør i en stationær rysteinkubator, indtil vævet bliver trævlet, og kollagenaseopløsningen bliver uklar. Spin ned 50 ml opløsning i fem til 10 minutter ved 1.500 RPM. Opsug supernatanten, og tilsæt 12 ml af basalmediet og bland ved pipettering op og ned tre til fire gange eller drej forsigtigt håndleddet, mens du holder røret 15 gange.Igen centrifugeres aspirat supernatant, tilsættes basalmedium, og blandes ved pipettering eller rørrotation som vist tidligere. Når de tungeste vævsfragmenter har lagt sig til bunden, opsamles supernatanten med en serologisk pipette og overføres til et konisk rør på 15 ml. Efter hver centrifugering skal du sikre dig, at pelleten bliver mere og mere uigennemsigtig.Alikvote passende suspension af organoider i mikrocentrifugeglas i overensstemmelse med organoiddensiteten i forhold til mængden af BECM pr. hul. Mikrocentrifugeglassene centrifugeres i 10 minutter ved 300 G ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres fra glassene. Flyt rørene med organoidpiller til is, og tilsæt den passende mængde BECM til hvert mikrocentrifugerør.Pipetter forsigtigt op og ned for at resuspendere organoiderne i BECM, og pas på ikke at producere bobler. Langsomt og forsigtigt pipetteres de suspenderede organoider fra BECM på pletteringsoverfladen, og alle de tomme brønde fyldes med PBS for at opretholde fugtigheden. Pladen anbringes i en inkubator med 37 grader Celsius i en time, så BECM kan størkne, og dæk derefter med en passende mængde medier.For at forberede kollagenopløsningen kombineres 375 mikroliter 10 gange koncentrationen af DMEM, 100 mikroliter af et normalt natriumhydroxid og tre ml rottehalekollagen I-opløsning i et 15 ml konisk rør. Pipette blandes, pas på ikke at lave bobler, og titrer opløsningen til en pH-værdi på 7,2 til 7,4 med en lille mængde natriumhydroxid eller 10 gange koncentrationen af DMEM efter behov. Overtræk bunden af brøndene med den mindste mængde kollagen, der kræves for fuldt ud at dække bunden af brønden ved at placere en lille mængde kollagen og vugge pladen fra side til side til frakke.Lad kollagenunderlagene sætte sig ved 37 grader Celsius i 30 minutter til to timer. Aliquot den passende suspension af organoider i mikrocentrifugeglas i henhold til organoiddensiteten i forhold til mængden af kollagen pr. Brønd. Opbevar kollagenopløsningen ved fire grader Celsius og overvåg polymerisationen ved at kontrollere fiberdannelse under et mikroskop hvert 10. minut.Mikrocentrifugeglassene centrifugeres ved 300 G i 10 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres fra glassene. Flyt de organoide pellets til is og tilsæt det passende volumen kollagen til hvert mikrocentrifugerør. Pipette forsigtigt op og ned for at resuspendere organoider i kollagen, pas på ikke at producere bobler.Langsomt og forsigtigt pipette kollagen suspenderede organoider på plettering overflade. De immunofluorescerende billeder af indlejrede organoider i enten kælder ekstracellulær matrix eller kollagen blev opnået for at studere vævssammensætningens ligheder mellem arter. Organoider indlejret i kollagenmatrix kan bruges til et invasionsassay og analyseres ved at spore udvidelsen af tendrils, der forgrener sig fra selve organoiden, enten gennem membrantomatmærkning eller phalloidinfarvning af actin.Endelig viser hæmatoxylin og eosinfarvning af paraffinindlejrede organoider, at organoider opretholder den samme histologi af brystkræft. Det er afgørende at holde BECM og kollagen koldt, mens du pipetterer gelerede kupler for at undgå for tidlig polymerisation. Derudover vil langvarig fastgørelse af kupler i PFA føre til geleret opløsning, hvis der udføres immunfluorescerende farvning.Organoider kan også anvendes i in vitro og in vivo procedurer såsom lægemiddelskærme og musemodeller af metastaser. Disse metoder kan give indsigt i terapeutisk følsomhed af tumorvæv, metastatiske egenskaber og immuninteraktioner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionukleid-fluorescens Reporter gen Imaging for at spore Tumor Progression i gnavere Tumor modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering af menneskelige endotelceller fra normale kolon og Colorectal karcinom - en forbedret protokol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rotte Mammary Epithelial Celletransplantation i Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Kultur, Manipulation, og ortotoptransplantation af mus blære Tumor organoider

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Måling Real-time Drug Response i organotypic tumorvæv skiver

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering af onkogene transformation i humane mammary epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

En etiketfri segmenteringsmetode til intravital billeddannelse af brysttumormikromiljø

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Kultur og billeddannelse af ex vivo organotypiske pseudomyxoma peritonei tumorskiver fra resekterede humane tumorprøver

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In vivo Genlevering til musebrystepitelceller gennem brystintraduktal injektion

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Bugspytkirtelkræft-afledte tumororganoider og fibroblaster fra frisk væv

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Forfatter Spotlight: Etablering af bugspytkirtelkræft-afledte tumororganoider og fibroblaster fra frisk væv  

Etablering af tumororganoider og fibroblaster afledt af kræft i bugspytkirtlen fra frisk væv

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...