Name: generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging
Uploaded: 2022-11-11T14:30:00
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Diese Studie wurde durch Mittel von METAvivor, dem Peter Carlson Trust, der Theresa's Research Foundation und dem NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543 unterstützt. Wir bedanken uns für die Unterstützung der University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, einer gemeinsamen Ressource am Simmons Comprehensive Cancer Center, die teilweise vom National Cancer Institute unter der Auszeichnungsnummer P30 CA142543 unterstützt wird. Besonderer Dank geht an alle Mitglieder des Chan Lab.

Das gesamte Mausgewebe, das in diesem Manuskript verwendet wird, wurde in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Southwestern Medical Center der University of Texas ethisch gesammelt. Ebenso stimmten alle Patienten vor der Gewebespende unter der Aufsicht eines Institutional Review Board (IRB) zu, und die Proben wurden anonymisiert.
HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Organoiden aus Primärgewebe.
...

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	<li>Ghandi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia.">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li><li>Roarty, K., Echeverria, G. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Padmanaban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+assays+for+murine+and+human+primary+and+metastatic-site+tumors.">Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors.</a> Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).</li></ol>

In der Literatur wurden verschiedene Methoden zur Erzeugung von Tumororganoiden beschrieben. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Erzeugung von Tumororganoiden direkt aus dem Tumor ohne Passage vor. Mit dieser Methode sind Tumor-Organoide innerhalb von Stunden nach Beginn des Verfahrens herstellbar und erzeugen nahezu 100 % lebensfähige Organoide, verglichen mit 70 % in der Literatur31. Im Vergleich dazu erfordern andere Methoden eine serielle Passage von Zellen in Organoide über mehrere Woc...

Die Fähigkeit, Epithelzellen in vitro zu modellieren, war die Grundlage der modernen biomedizinischen Forschung, da sie zelluläre Merkmale erfasst, die in vivo nicht zugänglich sind. Zum Beispiel kann das Züchten von Epithelzelllinien in einer zweidimensionalen Ebene eine Beurteilung der molekularen Veränderungen liefern, die in einer Epithelzelle während der Proliferation auftreten1. Darüber hinaus ist die Messung der dynamischen Regulation zwischen Signalübertragung und Genexpression in In-vivo-Systemen 2 begrenzt. In der Krebsforschung hat die Modellierung von Krebsepithelzelllinien die Identifizierung molekularer Treiber des Krankheitsverlaufs und potenzieller Wirkstoffziele ermöglicht3. Das Züchten von Krebsepithelzelllinien auf einer zweidimensionalen Ebene hat jedoch Grenzen, da die meisten genetisch immortalisiert und modifiziert sind, oft klonaler Natur, aufgrund ihrer Fähigkeit, unter nicht-physiologischen Bedingungen zu wachsen, ausgewählt wurden, in ihrer Beurteilung der dreidimensionalen (3D) Tumorgewebearchitektur begrenzt sind und Mikroumgebungsinteraktionen in einer realistischen Gewebeumgebung nicht angemessen modellieren4. Diese Einschränkungen zeigen sich besonders deutlich bei der Modellierung der Metastasierung, die in vivo mehrere verschiedene biologische Stadien umfasst, einschließlich Invasion, Verbreitung, Zirkulation und Kolonisierung an der entfernten Organstelle5.
Krebsepithel-Organoide wurden entwickelt, um die 3D-Umgebung und das Verhalten von Tumoren besser zu rekapitulieren 6,7,8. Organoide wurden zunächst aus einzelnen LRG5+ intestinalen Kryptenzellen entwickelt und differenziert, um die 3D-Struktur von Krypten-Zotten-Einheiten darzustellen, die die hierarchische Struktur des Dünndarms in vitro beibehalten 9. Dieser Ansatz ermöglichte die Echtzeit-Visualisierung und Charakterisierung der selbstorganisierenden Gewebearchitektur unter homöostatischen und Stressbedingungen. Als natürliche Erweiterung wurden Krebsepithel-Organoide entwickelt, um viele verschiedene Krebsarten zu modellieren, darunter Darmkrebs10, Bauchspeicheldrüse11, Brust 12, Leber 13, Lunge 14, Gehirn 15 und Magenkrebs 16. Krebsepithel-Organoide wurden genutzt, um die Krebsevolution17,18 und metastasiertes raumzeitliches Verhalten 19,20 zu charakterisieren und die Tumorheterogenität 21 zu untersuchen und Chemotherapienzu testen 22. Krebsepithel-Organoide wurden auch isoliert und während laufender klinischer Studien gesammelt, um das Ansprechen von Patienten auf Krebsmedikamente und Strahlentherapie ex vivo vorherzusagen 8,23,24,25. Darüber hinaus können Systeme, die Krebsepithel-Organoide enthalten, mit anderen Nicht-Krebszellen, wie z. B. Immunzellen, kombiniert werden, um ein umfassenderes Modell der Tumormikroumgebung zu bilden, um Interaktionen in Echtzeit zu visualisieren, aufzudecken, wie Krebsepithelzellen die grundlegende Natur von zytotoxischen Effektor-Immunzellen wie natürlichen Killerzellen verändern, und potenzielle Immuntherapien und antikörper-wirkstoffabhängige zytotoxische Aktivität zu testen26, 27,28. Dieser Artikel demonstriert eine Methode zur Erzeugung von Epithelorganoiden ohne Passage und Einbettung in Kollagen und basale extrazelluläre Matrix (ECM). Darüber hinaus werden auch Techniken für die nachgeschaltete Bildgebung von isolierten Organoiden geteilt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM HEPES Buffer</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Glutamax</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DMEM</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL/0.2 &#181;m filter flask</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>#564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Solution (32%)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Independent Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6546</td>
			<td>Common basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#10565-018</td>
			<td>Basal cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8662</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>#354230</td>
			<td>Basement Extracellular Matrix (BECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 N)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>SH3002701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging

Organoide sind aufgrund ihrer selbstorganisierenden Eigenschaften und der Beibehaltung von Funktion und Architektur nach der Vermehrung aus Primärgewebe oder Stammzellen eine zuverlässige Methode zur Modellierung von Organgewebe. Diese Methode der Organoiderzeugung verzichtet auf die Einzelzelldifferenzierung durch mehrere Passagen und verwendet stattdessen eine differentielle Zentrifugation, um Brustepithel-Organoide aus mechanisch und enzymatisch dissoziierten Geweben zu isolieren. Dieses Protokoll bietet eine optimierte Technik zur schnellen Herstellung kleiner und großer Epithelorganoide aus Maus- und menschlichem Brustgewebe sowie Techniken zur Einbettung von Organoiden in Kollagen und extrazelluläre Basalmatrix. Darüber hinaus werden Anweisungen zur In-Gel-Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung bereitgestellt, um die Morphologie und Dichte der Organoide sichtbar zu machen. Diese Methoden eignen sich für unzählige nachgelagerte Analysen, wie z. B. die Kokultivierung mit Immunzellen und die Ex-vivo-Metastasenmodellierung mittels Kollageninvasionsassay. Diese Analysen dienen dazu, das Zell-Zell-Verhalten besser aufzuklären und ein vollständigeres Verständnis der Wechselwirkungen innerhalb der Tumormikroumgebung zu schaffen.

Die in Abbildung 1 gezeigten Bilder zeigen ein Beispiel für Wildtyp- und tumoröse Brustepithelorganoide aus menschlichem und Mausgewebe. Eine auf einen Blick gezeigte Illustration der Methode zur Isolierung von Epithelorganoiden durch differentielle Zentrifugation ist im Cartoon-Workflow in Abbildung 1A zu sehen, der zeigt, dass Primärgewebe verschiedener Spezies auf nahezu identische Weise verarbeitet werden können, während Epithelgewebe entsteht, wie in d...

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Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

In diesem Protokoll wird ein Ansatz zur Erzeugung von Epithelorganoiden aus primärem Normal- und Tumorbrustgewebe durch differentielle Zentrifugation erörtert. Darüber hinaus sind Anleitungen für die dreidimensionale Kultivierung sowie die Immunfluoreszenz-Bildgebung von eingebetteten Organoiden enthalten.

Erzeugung und Bildgebung von Epithelorganoiden von Mäusen und Menschen aus normalem und Tumor-Brustgewebe ohne Passaging

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Dieses Protokoll ist bedeutsam für die Produktion von Gedächtnisepithelorganoiden, die ohne Passage erzeugt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Organoide nach enzymatischer Verdauung aus Brust- und Gedächtnisgewebe von Mensch und Maus isoliert werden können. Wir führen eine Reihe von differentiellen Zentrifugationsschritten durch, die Epithelorganoide isolieren, ohne Zellen passieren zu müssen.Eine Person, die diese Technik durchführt, kann auf Herausforderungen stoßen, wenn sie die Gewebe in Kollagen oder Matrix einbettet und sie in einer 96-Well-Platte plattiert. Darüber hinaus ist die Verwendung von richtig polymerisiertem Kollagen und die Beschichtung stabiler Kuppeln der Schlüssel zur Invasion. Sammeln Sie zunächst das Brustgewebe einer euthanasierten Maus, indem Sie die Gliedmaßen der Maus spreizen und die Maus mit vier 19-Gauge-Nadeln an den Pfoten an ein Brett heften, das mit einem saugfähigen Pad bedeckt ist, wobei die ventrale Seite nach oben zeigt.Sprühen Sie mit 70% Ethanol ein, um das Fell zu glätten und die Haut zu desinfizieren, und wischen Sie den Kot mit einem Mullkissen oder Taschentuch ab. Beginnen Sie direkt über der anogenitalen Region und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere von der Mittellinie nach oben und achten Sie darauf, das Peritoneum nicht zu durchbohren. Wenn Sie das Kinn erreichen, machen Sie seitliche Schnitte an beiden Schlüsselbeinen und an den Hinterbeinen und stecken Sie die Haut der Maus straff an das Brett, um Brustfettpolster freizulegen.Nachdem Sie die Leisten- und Brustfettpolster bei Wildtyp-Mäusen lokalisiert haben, verwenden Sie eine Pinzette, um das Brustfettpolster anzuheben. Erstellen Sie mit dem stumpfen Ende einer scharfen, stumpfen Schere eine Tasche unter dem Brustfettpolster von der Haut weg und schneiden Sie das Brustfettpolster in einem vollständigen Stück ab. Sobald die Brustfettpolster entfernt wurden, spülen Sie sie in PBS aus, bevor Sie sie in eine sterile Gewebekulturschale geben, und geben Sie sie dann schnell in eine Gewebekulturhaube.Zerkleinern Sie die Brusttumoren mit einem Skalpell Nummer 10 oder Nummer 11, um das Gewebe zu lockern, bis es eine pastöse Konsistenz erreicht. Das zerkleinerte Gewebe wird mit einem Skalpell in ein konisches Röhrchen mit 10 bis 30 Millilitern Kollagenaselösung überführt. Um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe gesammelt wird, pipettieren Sie einen Milliliter Kollagenaselösung auf die Gewebekulturplatte und zurück in das konische Röhrchen.Legen Sie das konische Röhrchen in einen Tisch-Schüttelinkubator, bis das Gewebe fadenförmig wird und die Kollagenaselösung trüb wird. 50 Milliliter Lösung für fünf bis 10 Minuten bei 1.500 U / min herunterschleudern. Saugen Sie den Überstand ab und fügen Sie 12 Milliliter des Basalmediums hinzu und mischen Sie, indem Sie drei- bis viermal auf und ab pipettieren oder das Handgelenk vorsichtig drehen, während Sie das Röhrchen 15 Mal halten.Drehen Sie erneut den Überstand ab, fügen Sie Basalmedium hinzu und mischen Sie durch Pipettieren oder Röhrchenrotation, wie zuvor gezeigt. Sobald sich die schwersten Gewebefragmente am Boden abgesetzt haben, sammeln Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette und geben Sie ihn in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie nach jeder Zentrifugation sicher, dass das Pellet zunehmend undurchsichtig wird.Aliquot geeignete Suspension von Organoiden in Mikrozentrifugenröhrchen entsprechend der Organoiddichte im Verhältnis zur Menge an BECM pro Well. Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen 10 Minuten lang bei 300 G bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand aus den Röhrchen. Bewegen Sie die Röhrchen mit Organoidpellets auf Eis und geben Sie das entsprechende Volumen BECM in jedes Mikrozentrifugenröhrchen.Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Organoide in BECM zu resuspendieren, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Pipettieren Sie die BECM-Schwebeorganoide langsam und vorsichtig auf die Beschichtungsoberfläche und füllen Sie alle leeren Vertiefungen mit PBS, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Legen Sie die Platte für eine Stunde in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, damit sich BECM verfestigen kann, und bedecken Sie sie dann mit der entsprechenden Medienmenge.Um die Kollagenlösung herzustellen, kombinieren Sie 375 Mikroliter der 10-fachen Konzentration von DMEM, 100 Mikroliter eines normalen Natriumhydroxids und drei Milliliter Rattenschwanz-Kollagen-I-Lösung in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie die Mischung, achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden, und titrieren Sie die Lösung auf einen pH-Wert von 7,2 bis 7,4 mit einer kleinen Menge Natriumhydroxid oder dem 10-fachen der DMEM-Konzentration nach Bedarf. Beschichten Sie den Boden der Vertiefungen mit der minimalen Menge an Kollagen, die erforderlich ist, um den Boden des Vertiefungss vollständig zu bedecken, indem Sie eine kleine Menge Kollagen auftragen und die Platte von einer Seite zur anderen schaukeln, um sie zu beschichten.Lassen Sie die Kollagenunterlagen 30 Minuten bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius aushärten. Aliquotieren Sie die geeignete Suspension von Organoiden in Mikrozentrifugenröhrchen entsprechend der Organoiddichte im Verhältnis zur Menge an Kollagen pro Vertiefung. Lagern Sie die Kollagenlösung bei vier Grad Celsius und überwachen Sie die Polymerisation, indem Sie alle 10 Minuten unter dem Mikroskop auf Faserbildung prüfen.Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen bei 300 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand aus den Röhrchen. Bewegen Sie die organoiden Pellets auf Eis und geben Sie das entsprechende Volumen Kollagen in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um Organoide in Kollagen zu resuspendieren, und achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden.Pipettieren Sie die Kollagen-suspendierten Organoide langsam und vorsichtig auf die Beschichtungsoberfläche. Die Immunfluoreszenzbilder von eingebetteten Organoiden entweder in der extrazellulären Matrix des Basals oder im Kollagen wurden erhalten, um die Ähnlichkeiten der Gewebezusammensetzung zwischen den Spezies zu untersuchen. Organoide, die in eine Kollagenmatrix eingebettet sind, können für einen Invasionstest verwendet und analysiert werden, indem die Ausdehnung von Ranken, die sich vom Organoid selbst verzweigen, entweder durch Membran-Tomatenmarkierung oder Phalloidin-Färbung von Aktin verfolgt wird.Schließlich zeigen Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen von in Paraffin eingebetteten Organoiden, dass Organoide die gleiche Histologie von Brustkrebs beibehalten. Es ist wichtig, BECM und Kollagen beim Pipettieren von gelierten Kuppeln kalt zu halten, um eine vorzeitige Polymerisation zu vermeiden. Darüber hinaus führt eine längere Fixierung der Kuppeln in PFA zu einer gelierten Lösung, wenn eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt wird.Organoide können auch in In-vitro- und In-vivo-Verfahren wie Arzneimittelscreenings und Mausmodelle von Metastasen verwendet werden. Diese Methoden können Einblicke in die therapeutische Sensitivität von Tumorgewebe, metastatische Eigenschaften und Immuninteraktionen geben.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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