Name: generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging
Uploaded: 2022-11-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מימון שסופק על ידי METAvivor, קרן פיטר קרלסון, קרן המחקר של תרזה, ומרכז הסרטן NCI/UTSW סימונס P30 CA142543. אנו מכירים בסיוע של University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, משאב משותף במרכז סימונס לסרטן מקיף, הנתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לסרטן תחת פרס מספר P30 CA142543. תודה מיוחדת לכל חברי מעבדת צ'אן.

כל רקמת העכבר המשמשת בכתב יד זה נאספה באופן אתי בהתאם לתקנות והנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המרכז הרפואי הדרום-מערבי של אוניברסיטת טקסס. כמו כן, כל החולים הסכימו לפני תרומת רקמות תחת פיקוח של ועדת ביקורת מוסדית (IRB), והדגימות זוהו.
הערה: פרוטוקול זה מת?...

<ol>
	<li>Ghandi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia.">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li><li>Roarty, K., Echeverria, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+models+for+investigating+breast+cancer+therapy+resistance+and+metastasis.">Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+New+dimensions.">Hallmarks of cancer: New dimensions.</a> Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biological+principles+of+metastasis.">Emerging biological principles of metastasis.</a> Cell. 168 (4), 670-691 (2017).</li><li>Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+organoids+for+cancer+biology+and+precision+medicine.">Applications of organoids for cancer biology and precision medicine.</a> Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Tuveson, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+modeling+meets+human+organoid+technology.">Cancer modeling meets human organoid technology.</a> Science. 364 (6444), 952-955 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorectal+tumor+organoid+library+demonstrates+progressive+loss+of+niche+factor+requirements+during+tumorigenesis.">A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+lung+cancer+organoids+as+in+vitro+cancer+models+for+therapeutic+screening.">Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening.</a> Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity.">A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Wrenn, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collective+metastasis+by+nanolumenal+signaling.">Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling.</a> Cell. 183 (2), 395-410 (2020).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+predict+chemoradiation+responses+of+locally+advanced+rectal+cancer.">Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).</li><li>Yao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pancreas+tumor+derived+organoid+study:+from+drug+screen+to+precision+medicine.">A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Chan, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+educate+natural+killer+cells+to+a+metastasis-promoting+cell+state.">Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state.</a> Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).</li><li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+co-culture+methods+to+capture+cancer+cell-natural+killer+cell+interactions.">Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).</li><li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+role+of+natural+killer+cells+in+cancer+metastasis.">The changing role of natural killer cells in cancer metastasis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+cancer+organoids.">Next-generation cancer organoids.</a> Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Padmanaban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+assays+for+murine+and+human+primary+and+metastatic-site+tumors.">Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors.</a> Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).</li></ol>

שיטות שונות תוארו בספרות ליצירת אורגנואידים סרטניים. פרוטוקול זה מדגיש שיטה ליצירת אורגנואידים סרטניים ישירות מהגידול ללא מעבר. באמצעות שיטה זו, אורגנואידים סרטניים ניתנים לייצור תוך שעות מתחילת ההליך ומייצרים קרוב ל -100% אורגנואידים קיימא לעומת 70% שדווחו בספרות31. לשם השוואה...

היכולת למדל תאי אפיתל במבחנה הייתה הבסיס למחקר הביו-רפואי המודרני מכיוון שהיא לוכדת תכונות תאיות שאינן נגישות in vivo. לדוגמה, גידול קווי תאי אפיתל במישור דו-ממדי יכול לספק הערכה של השינויים המולקולריים המתרחשים בתא אפיתל במהלך התפשטות1. יתר על כן, מדידת הוויסות הדינמי בין איתות לביטוי גנים מוגבלת במערכות in vivo 2. בחקר הסרטן, מידול קו תאי אפיתל של סרטן איפשר זיהוי של מניעים מולקולריים של התקדמות המחלה ומטרות פוטנציאליות של תרופות3. עם זאת, לגידול קווי תאי אפיתל סרטניים במישור דו-ממדי יש מגבלות, שכן רובם עברו אימורטליזציה גנטית והונדסה, לעתים קרובות משובטים בטבע, שנבחרו בשל יכולתם לגדול בתנאים לא פיזיולוגיים, מוגבלים בהערכתם את ארכיטקטורת רקמת הגידול התלת-ממדית (3D), ואינם מודלים כראוי אינטראקציות מיקרו-סביבה בסביבת רקמה מציאותית4. אילוצים אלה בולטים במיוחד במידול גרורות, אשר in vivo כולל כמה שלבים ביולוגיים ברורים, כולל פלישה, הפצה, מחזור והתיישבות באתר האיברים המרוחק5.
אורגנואידים אפיתל לסרטן פותחו כדי לשחזר טוב יותר את הסביבה התלת-ממדית ואת ההתנהגות של גידולים 6,7,8. אורגנואידים פותחו לראשונה מתאי קריפטה בודדים של המעי LRG5+ והתמיינו כדי לייצג את המבנה התלת-ממדי של יחידות קריפטו-וילוס ששמרו על המבנה ההיררכי של המעי הדק במבחנה9. גישה זו אפשרה הדמיה בזמן אמת ואפיון של ארכיטקטורת רקמות המארגנת את עצמה בתנאי הומיאוסטטיקה ולחץ. כהרחבה טבעית, אורגנואידים אפיתליאליים של סרטן פותחו כדי למדל סוגי סרטן רבים ושונים, כולל סרטן המעי הגס 10, לבלב11, שד 12, כבד 13, ריאות 14, מוח 15, וסרטן קיבה 16. אורגנואידים אפיתליאליים של סרטן נוצלו כדי לאפיין אבולוציה של סרטן17,18 והתנהגויות מרחביות-זמניות גרורתיות19,20 ולחקור הטרוגניות של הגידול21, ולבדוק כימותרפיות 22. אורגנואידים אפיתל לסרטן בודדו ונאספו גם במהלך ניסויים קליניים מתמשכים כדי לחזות את תגובת המטופלים לחומרים אנטי-סרטניים והקרנות ex vivo 8,23,24,25. יתר על כן, מערכות המשלבות אורגנואידים אפיתל סרטני יכולות להיות משולבות עם תאים אחרים שאינם סרטניים, כגון תאים חיסוניים, כדי ליצור מודל מקיף יותר של מיקרו-סביבה של הגידול כדי לדמיין אינטראקציות בזמן אמת, לחשוף כיצד תאי אפיתל סרטניים משנים את הטבע הבסיסי של תאים חיסוניים ציטוטוקסיים משפיעים כגון תאי הרג טבעיים, ולבדוק אימונותרפיה פוטנציאלית ופעילות ציטוטוקסית תלוית נוגדנים-תרופות26, 27,28. מאמר זה מדגים שיטה ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים ללא מעבר והטבעה בקולגן ובמטריצה חוץ-תאית במרתף (ECM). בנוסף, טכניקות להדמיה במורד הזרם של אורגנואידים מבודדים משותפות גם כן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM HEPES Buffer</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Glutamax</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DMEM</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL/0.2 &#181;m filter flask</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>#564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Solution (32%)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Independent Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6546</td>
			<td>Common basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#10565-018</td>
			<td>Basal cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8662</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>#354230</td>
			<td>Basement Extracellular Matrix (BECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 N)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>SH3002701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging

אורגנואידים הם שיטה אמינה למידול רקמת איברים בשל תכונות הארגון העצמי שלהם ושמירה על תפקוד וארכיטקטורה לאחר התפשטות מרקמה ראשונית או תאי גזע. שיטה זו של יצירת אורגנואידים מוותרת על התמיינות של תא בודד דרך מעברים מרובים ובמקום זאת משתמשת בצנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד אורגנואידים אפיתל חלב מרקמות מנותקות מכנית ואנזימטית. פרוטוקול זה מספק טכניקה יעילה לייצור מהיר של אורגנואידים אפיתליאליים קטנים וגדולים מרקמת חלב עכברית ואנושית, בנוסף לטכניקות להטמעת אורגנואידים בקולגן ובמטריצה חוץ-תאית במרתף. יתר על כן, הוראות לקיבוע בג'ל וצביעה אימונופלואורסצנטית ניתנות לצורך הדמיה של מורפולוגיה וצפיפות אורגנואידים. מתודולוגיות אלה מתאימות למספר עצום של ניתוחים במורד הזרם, כגון תרבית משותפת עם תאי מערכת החיסון ומידול גרורות ex vivo באמצעות בדיקת פלישה לקולגן. ניתוחים אלה משמשים להבהרה טובה יותר של התנהגות התא וליצירת הבנה מלאה יותר של אינטראקציות בתוך המיקרו-סביבה של הגידול.

התמונות המוצגות באיור 1 מספקות דוגמה לאורגנואידים אפיתל חלב מסוג בר וגידולים מרקמות אדם ועכבר. המחשה במבט חטוף של השיטה לבידוד אורגנואידים אפיתליאליים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית מוצגת בתהליך העבודה המצויר באיור 1A, המראה שרקמות ראשוניות ממינים שונים י...

Watch this Scientific Journal Video about Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging at JoVE.com

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

פרוטוקול זה דן בגישה ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים מרקמת חלב ראשונית נורמלית וגידולית באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. יתר על כן, הוראות כלולות עבור תרבית תלת מימדית, כמו גם הדמיה immunofluorescent של אורגנואידים משובצים.

הפקה והדמיה של אורגנואידים עכבריים ואפיתל אנושי מרקמת חלב רגילה וגידולית ללא מעבר

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

פרוטוקול זה משמעותי לייצור אורגנואידים אפיתליאליים של זיכרון הנוצרים ללא מעבר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד אורגנואידים מרקמת השד והזיכרון של האדם והעכבר לאחר עיכול אנזימטי. אנו מבצעים סדרה של צעדי צנטריפוגה דיפרנציאליים המבודדים אורגנואידים אפיתליאליים ללא צורך לעבור תאים.אדם המבצע טכניקה זו עלול להיתקל באתגרים בעת הטמעת הרקמות בקולגן או במטריצה וציפוין בתוך צלחת של 96 בארות. יתר על כן, שימוש בקולגן פולימרי כראוי וציפוי כיפות יציבות הוא המפתח לפלישה. כדי להתחיל, לאסוף את רקמת החלב של עכבר שעבר המתת חסד על ידי משחק גפיים עכבר באמצעות ארבע מחטים 19 מד, הצמד את העכבר על ידי הכפות ללוח מכוסה כרית סופג עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה.יש לרסס באתנול 70% כדי להחליק את הפרווה ולחטא את העור ולנגב את הצואה בעזרת פד גזה או רקמה. מתחילים ממש מעל האזור האנוגניטלי, חותכים כלפי מעלה מקו האמצע באמצעות מספריים כירורגיים תוך הקפדה לא לחדור דרך הצפק. עם ההגעה לסנטר, בצעו חתכים רוחביים במורד שתי עצמות הבריח ובמורד הרגליים האחוריות והצמידו את עור העכבר מתוח ללוח כדי לחשוף רפידות שומן חלב.לאחר איתור רפידות שומן החלב המפשעות והחזה על עכברי בר, השתמשו במלקחיים כדי להעלות את כרית שומן החלב. בעזרת הקצה הקהה של מספריים חדים וקהים, צרו כיס מתחת לכרית שומן החלב הרחק מהעור וחתכו את כרית שומן החלב בחתיכה אחת שלמה. לאחר הסרת רפידות שומן החלב, יש לשטוף ב-PBS לפני הכנסתן לצלחת תרבית רקמה סטרילית ולאחר מכן להעביר במהירות למכסה מנוע של תרבית רקמות.טחנו את גידולי החלב עם אזמל מספר 10 או מספר 11 כדי לשחרר את הרקמה עד שהיא מגיעה למרקם דמוי משחה. מעבירים את הרקמה הטחונה לתוך צינור חרוטי המכיל 10 עד 30 מיליליטר של תמיסת collagenase באמצעות אזמל. כדי להבטיח שכל הרקמה נאספת, פיפטה מיליליטר אחד של תמיסת collagenase על צלחת תרבית הרקמה ובחזרה לתוך הצינור החרוט.הכניסו את הצינור החרוטי לאינקובטור ניעור ספסל עד שהרקמה הופכת למחוטבת ותמיסת הקולגנאז הופכת לעכורה. סובב למטה 50 מיליליטר של פתרון במשך חמש עד 10 דקות ב 1, 500 סל"ד. שאפו סופרנטנט, הוסיפו 12 מיליליטר של המדיום הבסיסי וערבבו על ידי פיטום למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים או סובבו בעדינות את פרק כף היד תוך כדי החזקת הצינור 15 פעמים.שוב, לסובב כלפי מטה את השאיפה הסופרנטית, להוסיף מדיום בזאלי, ולערבב על ידי פיפטינג או סיבוב צינור כפי שהודגם קודם לכן. ברגע ששברי הרקמה הכבדים ביותר מתיישבים לתחתית, אוספים את הסופרנאטנט עם פיפטה סרולוגית ומעבירים אותו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר כל צנטריפוגה, ודא כי הגלולה הופכת אטומה יותר ויותר.Aliquot מתאים השעיה של אורגנואידים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות על פי צפיפות האורגנואידים ביחס לכמות BECM לכל באר. צנטריפוגות את צינורות המיקרו-צנטריפוגות למשך 10 דקות ב-300 גרם בטמפרטורת החדר ומשליכים את הסופרנאטנט מהצינורות. העבר את הצינורות עם כדורי אורגנואיד לקרח והוסף את הנפח המתאים של BECM לכל צינור מיקרוצנטריפוגה.פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את האורגנואידים ב- BECM, תוך הקפדה לא לייצר בועות. לאט ובזהירות מחזירים את האורגנואידים המרחפים של BECM על משטח הציפוי וממלאים את כל הבארות הריקות ב-PBS כדי לשמור על לחות. הכניסו את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לאפשר ל-BECM להתמצק ולאחר מכן כסו בנפח המדיה המתאים.כדי להכין את תמיסת הקולגן, ערבבו 375 מיקרוליטר של ריכוז פי 10 של DMEM, 100 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסידי רגיל אחד, ושלושה מיליליטר של תמיסת קולגן I זנב חולדה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. תערובת פיפטה, הקפדה לא ליצור בועות, וטיטראט התמיסה ל- pH של 7.2 עד 7.4 עם כמות קטנה של נתרן הידרוקסידי או פי 10 ריכוז DMEM לפי הצורך. מצפים את תחתית הבארות בכמות המינימלית של קולגן הנדרשת לכיסוי מלא של תחתית הבאר על ידי הנחת כמות קטנה של קולגן ומנדנדים את הצלחת מצד לצד לציפוי.תנו לשכבות הקולגן להתייצב על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעתיים. Aliquot את התרחיף המתאים של אורגנואידים לתוך צינורות microcentrifuge על פי צפיפות אורגנואיד ביחס לכמות קולגן לכל באר. אחסנו את תמיסת הקולגן בארבע מעלות צלזיוס ועקבו אחר פילמור על ידי בדיקת היווצרות סיבים תחת מיקרוסקופ כל 10 דקות.צנטריפוגות את צינורות המיקרו-צנטריפוגות ב-300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ומשליכים את הסופרנאטנט מהצינורות. העבירו את כדורי האורגנואיד לקרח והוסיפו את נפח הקולגן המתאים לכל צינור מיקרוצנטריפוגה. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות אורגנואידים בקולגן, נזהר לא לייצר בועות.לאט ובזהירות פיפטה קולגן מרחף אורגנואידים על משטח הציפוי. התמונות האימונופלואורסצנטיות של אורגנואידים משובצים במטריצה חוץ-תאית במרתף או בקולגן התקבלו כדי לחקור את הדמיון בהרכב הרקמה בין המינים. אורגנואידים המשובצים במטריצת קולגן יכולים לשמש לבדיקת פלישה ולנתח אותם על ידי מעקב אחר התפשטות הקנוקנות המסתעפות מהאורגנואיד עצמו באמצעות סימון עגבניות בקרום או צביעת פלואדין של אקטין (actin).לבסוף, המטוקסילין וצביעת אאוזין של אורגנואידים משובצים פרפין מראים כי אורגנואידים שומרים על אותה היסטולוגיה של סרטן השד. חשוב לשמור על קור BECM וקולגן בזמן הכנת כיפות ג'ל כדי למנוע פילמור מוקדם. בנוסף, קיבוע ממושך של כיפות ב-PFA יוביל לתמיסת ג'ל אם מבצעים צביעה אימונופלואורסצנטית.אורגנואידים יכולים לשמש גם במבחנה ובפרוצדורות in vivo כגון מסכי תרופות ומודלים עכבריים של גרורות. שיטות אלה יכולות לספק תובנות לגבי רגישות טיפולית של רקמת גידול, תכונות גרורתיות ואינטראקציות חיסוניות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

רדיונוקלידים-זריחה מדווח הדמיה כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול במודלים הגידול מכרסמים

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

בידוד של תאי אנדותל אדם נורמלי המעי הגס, סרטן המעי הגס - פרוטוקול משופר

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

חולדה השתלת תא האפיתל לתוך משטח שומן לבן הגלימה

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

תרבות, מניפולציה, והשתלת אורתוגרטופית של שלפוחית השתן של העכבר הגידול אורגנואידים

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

מדידת תגובת התרופה בזמן אמת בפרוסות רקמה אורגנוטימית לגידול

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

תרבית והדמיה של פרוסות גידול Pseudomyxoma peritonei אורגנוטיפיות Ex vivo מדגימות גידול אנושי מנותחות

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

אורגנואידים ופיברובלסטים שמקורם בסרטן הלבלב מרקמה טרייה

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

מחבר זרקור: הקמת אורגנואידים ופיברובלסטים של גידולים שמקורם בסרטן הלבלב מרקמה טרייה  

הקמת אורגנואידים ופיברובלסטים מגידולים שמקורם בסרטן הלבלב מרקמה טרייה

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...