Name: generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging
Uploaded: 2022-11-11T14:30:00
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Questo studio è stato supportato da finanziamenti forniti da METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation e NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Riconosciamo l'assistenza della University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, una risorsa condivisa presso il Simmons Comprehensive Cancer Center, che è supportata in parte dal National Cancer Institute con il numero di premio P30 CA142543. Un ringraziamento speciale a tutti i membri del Chan Lab.

Tutti i tessuti di topo utilizzati in questo manoscritto sono stati raccolti eticamente in conformità con i regolamenti e le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Texas Southwestern Medical Center. Allo stesso modo, tutti i pazienti hanno acconsentito prima della donazione di tessuti sotto la supervisione di un Institutional Review Board (IRB) e i campioni sono stati deidentificati.
NOTA: Questo protocollo descrive la generazione di organoid...

<ol>
	<li>Ghandi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia.">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li><li>Roarty, K., Echeverria, G. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+lung+cancer+organoids+as+in+vitro+cancer+models+for+therapeutic+screening.">Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening.</a> Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity.">A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li><li>Yan, H. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collective+metastasis+by+nanolumenal+signaling.">Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling.</a> Cell. 183 (2), 395-410 (2020).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+predict+chemoradiation+responses+of+locally+advanced+rectal+cancer.">Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).</li><li>Yao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pancreas+tumor+derived+organoid+study:+from+drug+screen+to+precision+medicine.">A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Chan, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+educate+natural+killer+cells+to+a+metastasis-promoting+cell+state.">Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state.</a> Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).</li><li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+co-culture+methods+to+capture+cancer+cell-natural+killer+cell+interactions.">Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).</li><li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+role+of+natural+killer+cells+in+cancer+metastasis.">The changing role of natural killer cells in cancer metastasis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+cancer+organoids.">Next-generation cancer organoids.</a> Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Padmanaban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+assays+for+murine+and+human+primary+and+metastatic-site+tumors.">Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors.</a> Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).</li></ol>

Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per generare organoidi tumorali. Questo protocollo evidenzia un metodo per generare organoidi tumorali direttamente dal tumore senza passare. Utilizzando questo metodo, gli organoidi tumorali sono producibili entro poche ore dall'inizio della procedura e generano quasi il 100% di organoidi vitali rispetto al 70% riportato in letteratura31. In confronto, altri metodi richiedono il passaggio seriale delle cellule in organoidi per diverse settimane. ...

La capacità di modellare le cellule epiteliali in vitro è stata il fondamento della moderna ricerca biomedica perché cattura caratteristiche cellulari che non sono accessibili in vivo. Ad esempio, la crescita di linee cellulari epiteliali in un piano bidimensionale può fornire una valutazione dei cambiamenti molecolari che si verificano in una cellula epiteliale durante la proliferazione1. Inoltre, la misurazione della regolazione dinamica tra segnalazione ed espressione genica è limitata nei sistemi in vivo 2. Nella ricerca sul cancro, la modellazione della linea cellulare epiteliale del cancro ha permesso l'identificazione dei driver molecolari della progressione della malattia e dei potenziali bersagli farmacologici3. Tuttavia, la crescita di linee cellulari epiteliali tumorali su un piano bidimensionale ha dei limiti, poiché la maggior parte sono geneticamente immortalate e modificate, spesso di natura clonale, selezionate per la loro capacità di crescere in condizioni non fisiologiche, limitate nella loro valutazione dell'architettura tridimensionale (3D) del tessuto tumorale e non modellano adeguatamente le interazioni del microambiente all'interno di un ambiente tissutale realistico4. Questi vincoli sono particolarmente evidenti nella modellazione delle metastasi, che in vivo include diverse fasi biologiche distinte, tra cui invasione, disseminazione, circolazione e colonizzazione nel sito dell'organo distante5.
Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sviluppati per ricapitolare meglio l'ambiente 3D e il comportamento dei tumori 6,7,8. Gli organoidi sono stati inizialmente sviluppati da singole cellule della cripta intestinale LRG5+ e differenziati per rappresentare la struttura 3D delle unità crypt-villus che hanno mantenuto la struttura gerarchica dell'intestino tenue in vitro9. Questo approccio ha permesso la visualizzazione in tempo reale e la caratterizzazione dell'architettura tissutale auto-organizzante in condizioni omeostatiche e di stress. Come estensione naturale, gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sviluppati per modellare molti diversi tipi di cancro, tra cui colorettale 10, pancreatico 11, seno12, fegato 13, polmone 14, cervello 15 e tumori gastrici 16. Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sfruttati per caratterizzare l'evoluzione del cancro17,18 e i comportamenti spazio-temporali metastatici 19,20 e interrogare l'eterogeneità tumorale 21 e testare le chemioterapie 22. Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati anche isolati e raccolti durante gli studi clinici in corso per prevedere la risposta del paziente agli agenti antitumorali e alla radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Inoltre, i sistemi che incorporano organoidi epiteliali tumorali possono essere combinati con altre cellule non tumorali, come le cellule immunitarie, per formare un modello più completo del microambiente tumorale per visualizzare le interazioni in tempo reale, scoprire come le cellule epiteliali tumorali cambiano la natura fondamentale delle cellule immunitarie effettrici citotossiche come le cellule natural killer e testare potenziali immunoterapie e attività citotossica anticorpo-farmaco dipendente26, 27,28. Questo articolo dimostra un metodo per generare organoidi epiteliali senza passare e incorporare nel collagene e nella matrice extracellulare basale (ECM). Inoltre, vengono condivise anche tecniche per l'imaging a valle di organoidi isolati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM HEPES Buffer</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Glutamax</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DMEM</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL/0.2 &#181;m filter flask</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>#564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Solution (32%)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Independent Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6546</td>
			<td>Common basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#10565-018</td>
			<td>Basal cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8662</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>#354230</td>
			<td>Basement Extracellular Matrix (BECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 N)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>SH3002701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging

Gli organoidi sono un metodo affidabile per modellare il tessuto degli organi grazie alle loro proprietà auto-organizzanti e alla conservazione della funzione e dell'architettura dopo la propagazione dal tessuto primario o dalle cellule staminali. Questo metodo di generazione di organoidi rinuncia alla differenziazione di singole cellule attraverso passaggi multipli e utilizza invece la centrifugazione differenziale per isolare organoidi epiteliali mammari da tessuti dissociati meccanicamente ed enzimaticamente. Questo protocollo fornisce una tecnica semplificata per produrre rapidamente organoidi epiteliali piccoli e grandi sia dal tessuto mammario di topo che da quello umano, oltre alle tecniche per l'incorporazione di organoidi nel collagene e nella matrice extracellulare basale. Inoltre, vengono fornite istruzioni per la fissazione in gel e la colorazione immunofluorescente allo scopo di visualizzare la morfologia e la densità degli organoidi. Queste metodologie sono adatte per una miriade di analisi a valle, come la co-coltura con cellule immunitarie e la modellazione di metastasi ex vivo tramite il saggio di invasione del collagene. Queste analisi servono a chiarire meglio il comportamento cellula-cellula e creare una comprensione più completa delle interazioni all'interno del microambiente tumorale.

Le immagini presenti nella Figura 1 forniscono un esempio di organoidi epiteliali mammari wild-type e tumorali provenienti da tessuti umani e murini. Un'illustrazione a colpo d'occhio del metodo per isolare gli organoidi epiteliali attraverso la centrifugazione differenziale è fornita nel flusso di lavoro del fumetto nella Figura 1A, che mostra che i tessuti primari di specie diverse possono essere trattati in modi quasi identici mentre producono tessuto epitel...

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Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Questo protocollo discute un approccio per generare organoidi epiteliali dal tessuto mammario primario normale e tumorale attraverso la centrifugazione differenziale. Inoltre, sono incluse istruzioni per la coltura tridimensionale e l'imaging immunofluorescente di organoidi incorporati.

Generazione e imaging di organoidi epiteliali di topo e umani da tessuto mammario normale e tumorale senza passaggio

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Questo protocollo è significativo per la produzione di organoidi epiteliali di memoria che vengono generati senza passaggio. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli organoidi possono essere isolati dal seno umano e di topo e dal tessuto di memoria dopo la digestione enzimatica. Eseguiamo una serie di fasi di centrifugazione differenziale che isolano gli organoidi epiteliali senza dover far passare le cellule.Un individuo che esegue questa tecnica può affrontare sfide quando incorpora i tessuti nel collagene o nella matrice e li placca all'interno di una piastra a 96 pozzetti. Inoltre, l'uso di collagene correttamente polimerizzato e cupole stabili di placcatura è la chiave per vedere l'invasione. Per iniziare, raccogli il tessuto mammario di un topo eutanasia allargando gli arti del topo e usando quattro aghi calibro 19, blocca il topo per le zampe su una tavola coperta da un cuscinetto assorbente con il lato ventrale rivolto verso l'alto.Spruzzare con etanolo al 70% per levigare il pelo e disinfettare la pelle e pulire le feci con una garza o un fazzoletto. Partendo appena sopra la regione anogenitale, tagliare verso l'alto dalla linea mediana usando le forbici chirurgiche facendo attenzione a non perforare il peritoneo. Una volta raggiunto il mento, effettuare tagli laterali lungo entrambe le clavicole e lungo le zampe posteriori e appuntare la pelle del topo tesa alla tavola per esporre i cuscinetti di grasso mammario.Dopo aver individuato i cuscinetti di grasso mammario inguinale e toracico sui topi selvatici, utilizzare una pinza per elevare il cuscinetto di grasso mammario. Usando l'estremità smussata delle forbici smussate affilate, creare una tasca sotto il cuscinetto di grasso mammario lontano dalla pelle e tagliare via il cuscinetto di grasso mammario in un unico pezzo. Una volta rimossi i cuscinetti di grasso mammario, sciacquare in PBS prima di metterli in una capsula di coltura di tessuto sterile e quindi trasferire rapidamente in una cappa di coltura tissutale.Tritare i tumori mammari con un bisturi numero 10 o numero 11 per allentare il tessuto fino a raggiungere una consistenza simile alla pasta. Trasferire il tessuto tritato in un tubo conico contenente da 10 a 30 millilitri di soluzione di collagenasi usando un bisturi. Per garantire che tutto il tessuto sia raccolto, pipettare un millilitro di soluzione di collagenasi sulla piastra di coltura tissutale e di nuovo nel tubo conico.Posizionare il tubo conico in un'incubatrice da banco fino a quando il tessuto diventa stopposo e la soluzione di collagenasi diventa torbida. Centrifugare 50 millilitri di soluzione per cinque a 10 minuti a 1.500 giri / min. Aspirare il surnatante e aggiungere 12 millilitri del mezzo basale e mescolare pipettando su e giù tre o quattro volte o ruotare delicatamente il polso tenendo il tubo 15 volte.Anche in questo caso, spin down aspirare il supernatante, aggiungere il mezzo basale e mescolare mediante pipettaggio o rotazione del tubo come dimostrato in precedenza. Una volta che i frammenti di tessuto più pesanti si depositano sul fondo, raccogliere il surnatante con una pipetta sierologica e trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo ogni centrifugazione, assicurarsi che il pellet diventi sempre più opaco.Aliquot sospensione appropriata di organoidi in provette da microcentrifuga in base alla densità degli organoidi rispetto alla quantità di BECM per pozzetto. Centrifugare le provette per microcentrifuga per 10 minuti a 300 G a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante dalle provette. Spostare i tubi con pellet organoidi sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di BECM a ciascuna provetta da microcentrifuga.Pipettare delicatamente su e giù per risospendere gli organoidi in BECM, facendo attenzione a non produrre bollicine. Pipettare lentamente e con cura gli organoidi sospesi BECM sulla superficie di placcatura e riempire tutti i pozzetti vuoti con PBS per mantenere l'umidità. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire al BECM di solidificarsi e quindi coprire con il volume appropriato di supporto.Per preparare la soluzione di collagene, combinare 375 microlitri di 10 volte la concentrazione di DMEM, 100 microlitri di un normale idrossido di sodio e tre millilitri di soluzione di collagene I a coda di ratto in un tubo conico da 15 millilitri. Mescolare le pipette, facendo attenzione a non formare bolle, e titolare la soluzione a un pH compreso tra 7,2 e 7,4 con una piccola quantità di idrossido di sodio o 10 volte la concentrazione di DMEM secondo necessità. Rivestire il fondo dei pozzetti con la quantità minima di collagene necessaria per coprire completamente il fondo del pozzetto posizionando una piccola quantità di collagene e scuotere la piastra da un lato all'altro per rivestire.Lasciare che i sottostrati di collagene si stabilizzino a 37 gradi Celsius per 30 minuti a due ore. Aliquot la sospensione appropriata di organoidi in provette da microcentrifuga in base alla densità organoide relativa alla quantità di collagene per pozzetto. Conservare la soluzione di collagene a quattro gradi Celsius e monitorare la polimerizzazione controllando la formazione di fibre al microscopio ogni 10 minuti.Centrifugare le provette da microcentrifuga a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante dalle provette. Spostare i pellet organoidi sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di collagene a ciascuna provetta di microcentrifuga. Pipettare delicatamente su e giù per risospendere gli organoidi nel collagene, facendo attenzione a non produrre bolle.Pipettare lentamente e con attenzione gli organoidi sospesi al collagene sulla superficie di placcatura. Le immagini immunofluorescenti di organoidi incorporati nella matrice extracellulare basale o nel collagene sono state ottenute per studiare le somiglianze della composizione tissutale inter-specie. Gli organoidi incorporati nella matrice di collagene possono essere utilizzati per un test di invasione e analizzati monitorando l'espansione dei viticci che si diramano dall'organoide stesso attraverso l'etichettatura del pomodoro di membrana o la colorazione falloidina dell'actina.Infine, la colorazione con ematossilina ed eosina degli organoidi incorporati in paraffina mostra che gli organoidi mantengono la stessa istologia del cancro al seno. È fondamentale mantenere freddi BECM e collagene durante il pipettaggio delle cupole gelificate per evitare la polimerizzazione prematura. Inoltre, il fissaggio prolungato delle cupole in PFA porterà a una soluzione gelificata se si esegue la colorazione immunofluorescente.Gli organoidi possono anche essere utilizzati in procedure in vitro e in vivo come screening di farmaci e modelli murini di metastasi. Questi metodi possono fornire approfondimenti sulla sensibilità terapeutica del tessuto tumorale, sulle proprietà metastatiche e sulle interazioni immunitarie.

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