Name: generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging
Uploaded: 2022-11-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging at JoVE.com

Denne studien ble støttet av finansiering fra METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation og NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Vi anerkjenner assistansen fra University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, en delt ressurs ved Simmons Comprehensive Cancer Center, som delvis støttes av National Cancer Institute under tildelingsnummer P30 CA142543. Spesiell takk til alle medlemmer av Chan Lab.

Alt musevev som brukes i dette manuskriptet er etisk samlet i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) forskrifter og retningslinjer fra University of Texas Southwestern Medical Center. Likeledes samtykket alle pasientene før vevsdonasjon under tilsyn av en Institutional Review Board (IRB), og prøvene ble avidentifisert.
MERK: Denne protokollen beskriver generering av organoider fra primærvev.
1. Forberedelse av materialer over natten...

<ol>
	<li>Ghandi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia.">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li><li>Roarty, K., Echeverria, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+models+for+investigating+breast+cancer+therapy+resistance+and+metastasis.">Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+New+dimensions.">Hallmarks of cancer: New dimensions.</a> Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biological+principles+of+metastasis.">Emerging biological principles of metastasis.</a> Cell. 168 (4), 670-691 (2017).</li><li>Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+organoids+for+cancer+biology+and+precision+medicine.">Applications of organoids for cancer biology and precision medicine.</a> Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Tuveson, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+modeling+meets+human+organoid+technology.">Cancer modeling meets human organoid technology.</a> Science. 364 (6444), 952-955 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorectal+tumor+organoid+library+demonstrates+progressive+loss+of+niche+factor+requirements+during+tumorigenesis.">A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+lung+cancer+organoids+as+in+vitro+cancer+models+for+therapeutic+screening.">Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening.</a> Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity.">A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Wrenn, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collective+metastasis+by+nanolumenal+signaling.">Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling.</a> Cell. 183 (2), 395-410 (2020).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+predict+chemoradiation+responses+of+locally+advanced+rectal+cancer.">Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).</li><li>Yao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pancreas+tumor+derived+organoid+study:+from+drug+screen+to+precision+medicine.">A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Chan, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+educate+natural+killer+cells+to+a+metastasis-promoting+cell+state.">Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state.</a> Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).</li><li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+co-culture+methods+to+capture+cancer+cell-natural+killer+cell+interactions.">Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).</li><li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+role+of+natural+killer+cells+in+cancer+metastasis.">The changing role of natural killer cells in cancer metastasis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+cancer+organoids.">Next-generation cancer organoids.</a> Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Padmanaban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+assays+for+murine+and+human+primary+and+metastatic-site+tumors.">Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors.</a> Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).</li></ol>

Ulike metoder har blitt beskrevet i litteraturen for å generere tumororganoider. Denne protokollen fremhever en metode for å generere tumororganoider direkte fra svulsten uten å passere. Ved hjelp av denne metoden er tumororganoider produserbare innen timer etter initiering av prosedyren og genererer nær 100% levedyktige organoider sammenlignet med 70% rapportert i litteraturen31. Til sammenligning krever andre metoder seriell passasje av celler til organoider over flere uker. Dermed blir neds...

Evnen til å modellere epitelceller in vitro har vært grunnlaget for moderne biomedisinsk forskning fordi den fanger opp cellulære egenskaper som ikke er tilgjengelige in vivo. For eksempel kan voksende epitelcellelinjer i et todimensjonalt plan gi en vurdering av molekylære endringer som forekommer i en epitelcelle under proliferasjon1. Videre er måling av dynamisk regulering mellom signalering og genuttrykk begrenset i in vivo-systemer 2. I kreftforskning har kreftepitelcellelinjemodellering gjort det mulig å identifisere molekylære drivere for sykdomsprogresjon og potensielle legemiddelmål3. Imidlertid har voksende kreftepitelcellelinjer på et todimensjonalt plan begrensninger, da de fleste er genetisk udødeliggjort og modifisert, ofte klonale i naturen, valgt for deres evne til å vokse i ikke-fysiologiske forhold, begrenset i deres vurdering av tredimensjonal (3D) tumorvevsarkitektur, og ikke tilstrekkelig modellere mikromiljøinteraksjoner i et realistisk vevsmiljø4. Disse begrensningene er spesielt tydelige i modelleringsmetastase, som in vivo inkluderer flere distinkte biologiske stadier, inkludert invasjon, formidling, sirkulasjon og kolonisering på det fjerne organstedet5.
Kreftepitelorganoider er utviklet for bedre å rekapitulere 3D-miljøet og oppførselen til svulster 6,7,8. Organoider ble først utviklet fra enkle LRG5+ tarmkryptceller og differensiert for å representere 3D-strukturen til krypt-villus-enheter som opprettholdt tynntarmens hierarkiske struktur in vitro9. Denne tilnærmingen tillot sanntidsvisualisering og karakterisering av selvorganiserende vevsarkitektur under homeostatiske og stressforhold. Som en naturlig forlengelse ble kreftepitelorganoider utviklet for å modellere mange forskjellige krefttyper, inkludert kolorektal10, bukspyttkjertel 11, bryst 12, lever 13, lunge 14, hjerne 15 og magekreft 16. Kreftepitelorganoider har blitt utnyttet til å karakterisere kreftutvikling17,18 og metastatisk spatiotemporal atferd 19,20 og forhøre tumorheterogenitet 21 og teste kjemoterapier 22. Kreftepitelorganoider har også blitt isolert og samlet under pågående kliniske studier for å forutsi pasientrespons på kreftmidler og strålebehandling ex vivo 8,23,24,25. Videre kan systemer som inneholder kreftepitelorganoider kombineres med andre ikke-kreftceller, for eksempel immunceller, for å danne en mer omfattende modell av tumormikromiljøet for å visualisere interaksjoner i sanntid, avdekke hvordan kreftepitelceller endrer den grunnleggende naturen til cytotoksiske effektorimmunceller som naturlige drepeceller, og teste potensielle immunterapier og antistoff-legemiddelavhengig cytotoksisk aktivitet26, 27,28. Denne artikkelen demonstrerer en metode for å generere epitelorganoider uten å passere og legge inn i kollagen og kjeller ekstracellulær matrise (ECM). I tillegg deles teknikker for nedstrøms avbildning av isolerte organoider.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM HEPES Buffer</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Glutamax</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DMEM</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL/0.2 &#181;m filter flask</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>#564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Solution (32%)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Independent Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6546</td>
			<td>Common basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#10565-018</td>
			<td>Basal cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8662</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>#354230</td>
			<td>Basement Extracellular Matrix (BECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 N)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>SH3002701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging

Organoider er en pålitelig metode for modellering av organvev på grunn av deres selvorganiserende egenskaper og oppbevaring av funksjon og arkitektur etter forplantning fra primærvev eller stamceller. Denne metoden for organoid generering avstår fra enkeltcelledifferensiering gjennom flere passasjer og bruker i stedet differensiell sentrifugering for å isolere brystepitelorganoider fra mekanisk og enzymatisk dissosierte vev. Denne protokollen gir en strømlinjeformet teknikk for raskt å produsere små og store epitelorganoider fra både mus og humant brystvev i tillegg til teknikker for organoidinnebygging i kollagen og kjeller ekstracellulær matrise. Videre er instruksjoner for fiksering av gel og immunfluorescerende farging gitt med det formål å visualisere organoid morfologi og tetthet. Disse metodene er egnet for utallige nedstrømsanalyser, for eksempel samdyrking med immunceller og ex vivo metastasemodellering via kollageninvasjonsanalyse. Disse analysene tjener til å bedre belyse cellecellenes oppførsel og skape en mer fullstendig forståelse av interaksjoner i tumormikromiljøet.

Bildene i figur 1 gir et eksempel på villtype og tumorøse brystepitelorganoider fra vev fra mennesker og mus. En kort illustrasjon av metoden for isolering av epitelorganoider gjennom differensialsentrifugering er gitt i tegneseriearbeidsflyten i figur 1A, som viser at primærvev fra forskjellige arter kan behandles på nesten identiske måter mens de gir epitelvev som vist på lysfeltbildene (figur 1B ). Videre kan disse vevssamm...

Watch this Scientific Journal Video about Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging at JoVE.com

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Denne protokollen diskuterer en tilnærming for å generere epitelorganoider fra primær normal og tumor brystvev gjennom differensial sentrifugering. Videre er instruksjoner inkludert for tredimensjonal dyrking samt immunfluorescerende avbildning av innebygde organoider.

Generering og avbildning av mus og humane epitelorganoider fra normalt og tumorbrystvev uten å passere

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Denne protokollen er viktig for produksjon av minneepitelorganoider som genereres uten å passere. Den største fordelen med denne teknikken er at organoider kan isoleres fra bryst- og minnevev fra mennesker og mus etter enzymatisk fordøyelse. Vi utfører en rekke differensialsentrifugeringstrinn som isolerer epitelorganoider uten å måtte passere celler.En person som utfører denne teknikken kan møte utfordringer når de legger inn vevene i kollagen eller matrise og plating dem i en 96-brønnsplate. Videre er bruk av riktig polymerisert kollagen og plating stabile kupler nøkkelen til å se invasjon. For å begynne, samle brystvevet til en euthanisert mus ved å spille muselemmer og bruke fire 19 gauge nåler, fest musen ved potene til et brett dekket med en absorberende pute med ventralsiden vendt oppover.Spray med 70% etanol for å glatte pelsen ned og desinfisere huden og tørk bort avføring med en gasbind eller vev. Start like over den anogenitale regionen, kutt oppover fra midtlinjen ved hjelp av kirurgisk saks, pass på at du ikke pierce gjennom bukhinnen. Når du når haken, gjør du laterale kutt ned begge kragebenene og nedover bakbenene og fester musens hud stramt til brettet for å avsløre brystfettputer.Etter å ha funnet inguinal og thoracic mammary fett pads på vill type mus, bruk tang for å heve brystfettputen. Bruk den stumpe enden av skarp, stump saks, lag en lomme under brystfettputen vekk fra huden og klipp bort brystfettputen i ett komplett stykke. Når brystfettputer er fjernet, skyll i PBS før du legger dem i en steril vevskulturskål og overfør deretter raskt til en vevskulturhette.Hakk brystsvulstene med et nummer 10 eller nummer 11 skalpell for å løsne vev til det når en pastalignende konsistens. Overfør hakket vev til et konisk rør som inneholder 10 til 30 ml kollagenaseoppløsning ved hjelp av en skalpell. For å sikre at alt vev samles opp, pipetter du en milliliter kollagenaseoppløsning på vevskulturplaten og tilbake i det koniske røret.Plasser det koniske røret i en benkeplate ristende inkubator til vevet blir trevlet og kollagenaseoppløsningen blir overskyet. Spinn ned 50 ml løsning i fem til 10 minutter ved 1.500 RPM. Aspirat supernatant, og tilsett 12 ml av basalmediet og bland ved å pipettere opp og ned tre til fire ganger eller roter håndleddet forsiktig mens du holder røret 15 ganger.Igjen, spinn ned aspiratsupernatant, tilsett basalmedium og bland ved pipettering eller rørrotasjon som vist tidligere. Når de tyngste vevfragmentene legger seg til bunnen, samler supernatanten med en serologisk pipette og overfører den til et 15 milliliter konisk rør. Etter hver sentrifugering, sørg for at pelleten blir stadig mer ugjennomsiktig.Aliquot passende suspensjon av organoider i mikrosentrifugerør i henhold til organoidtettheten i forhold til mengden BECM per brønn. Sentrifuger mikrosentrifugerørene i 10 minutter ved 300 G ved romtemperatur og kast supernatanten fra rørene. Flytt rørene med organoide pellets til is og tilsett passende volum BECM til hvert mikrosentrifugerør.Pipetter forsiktig opp og ned for å resuspendere organoidene i BECM, og pass på at det ikke dannes bobler. Pipetter BECM sakte og forsiktig suspenderte organoider på pletteringsoverflaten og fyll alle tomme brønner med PBS for å opprettholde fuktighet. Plasser platen i en 37 grader Celsius-inkubator i en time for å la BECM stivne og deretter dekke med riktig volum medier.For å forberede kollagenoppløsningen, kombiner 375 mikroliter 10 ganger konsentrasjonen av DMEM, 100 mikroliter av ett normalt natriumhydroksyd og tre milliliter rottehalekollagen I-løsning i et 15 milliliter konisk rør. Pipetteblanding, pass på at du ikke lager bobler, og titrer oppløsningen til en pH på 7,2 til 7,4 med en liten mengde natriumhydroksid eller 10 ganger konsentrasjonen av DMEM etter behov. Belegg bunnen av brønnene med den minste mengden kollagen som kreves for å dekke bunnen av brønnen helt ved å plassere en liten mengde kollagen og stein platen fra side til side til frakk.La kollagenunderlagene stivne ved 37 grader Celsius i 30 minutter til to timer. Aliquot riktig suspensjon av organoider i mikrosentrifugerør i henhold til organoidtettheten i forhold til mengden kollagen per brønn. Oppbevar kollagenoppløsningen ved fire grader Celsius og overvåk polymerisasjonen ved å sjekke for fiberdannelse under et mikroskop hvert 10. minutt.Sentrifuger mikrosentrifugerørene ved 300 G i 10 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten fra rørene. Flytt organoidpellets til is og tilsett passende volum kollagen til hvert mikrosentrifugerør. Pipetter forsiktig opp og ned for å resuspendere organoider i kollagen, pass på at du ikke produserer bobler.Sakte og forsiktig pipette kollagenet suspendert organoider på pletteringsoverflaten. De immunfluorescerende bildene av innebygde organoider i enten kjeller, ekstracellulær matriks eller kollagen ble oppnådd for å studere vevssammensetningslikhetene mellom arter. Organoider innebygd i kollagenmatrise kan brukes til en invasjonsanalyse og analyseres ved å spore utvidelsen av tendrils som forgrener seg fra organoidet selv, enten gjennom membrantomatmerking eller falloidinfarging av aktin.Til slutt viser hematoksylin- og eosinfarging av parafininnebygde organoider at organoider opprettholder samme histologi av brystkreft. Det er avgjørende å holde BECM og kollagen kaldt mens du pipetterer gelerte kupler for å unngå for tidlig polymerisering. I tillegg vil langvarig fiksering av kupler i PFA føre til gelert løsning hvis du utfører immunfluorescerende farging.Organoider kan også brukes in vitro og in vivo prosedyrer som legemiddelskjermer og musemodeller av metastase. Disse metodene kan gi innsikt i terapeutisk følsomhet av tumorvev, metastatiske egenskaper og immuninteraksjoner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklidenes-fluorescens Reporter genet å spore svulst progresjon i gnager svulst modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering av menneskelig endotelceller fra Normal kolon og Colorectal Carcinoma - en forbedret protokoll

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rotte mammary epitelcelletransplantasjon i Interscapular Hvit Fett Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Kultur, manipulering og ortopisk transplantasjon av museblære tumor organoider

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Måle sanntids narkotikarespons i organotypic tumor vev skiver

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering av onkogen transformasjon i humane pattedyr epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Studere TGF-β signalisering og TGF-β-indusert epitel-til-mesenchymal overgang i brystkreft og normale celler

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

En etikettfri segmenteringstilnærming for intravital avbildning av mammary tumormikromiljø

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Kultur og avbildning av Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Skiver fra resected Human Tumor Specimens

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In vivo Genlevering i musepitelceller gjennom intraduktal injeksjon

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...