Name: generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging
Uploaded: 2022-11-11T14:30:00
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Este estudo foi apoiado pelo financiamento fornecido pelo METAvivor, o Peter Carlson Trust, a Theresa's Research Foundation e o NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Reconhecemos a assistência do Recurso Compartilhado de Gerenciamento de Tecidos do Sudoeste da Universidade do Texas, um recurso compartilhado no Simmons Comprehensive Cancer Center, que é apoiado em parte pelo Instituto Nacional do Câncer sob o número de prêmio P30 CA142543. Agradecimentos especiais a todos os membros do Chan Lab.

Todo o tecido de camundongo utilizado neste manuscrito foi coletado eticamente de acordo com os regulamentos e diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas. Da mesma forma, todos os pacientes consentiram antes da doação de tecidos sob a supervisão de um Comitê de Revisão Institucional (IRB), e as amostras foram desidentificadas.
NOTA: Este protocolo descreve a geração de organoides a partir do tecido prim...

<ol>
	<li>Ghandi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia.">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li><li>Roarty, K., Echeverria, G. 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T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+cancer+organoids.">Next-generation cancer organoids.</a> Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Padmanaban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+assays+for+murine+and+human+primary+and+metastatic-site+tumors.">Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors.</a> Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).</li></ol>

Diferentes métodos têm sido descritos na literatura para gerar organoides tumorais. Este protocolo destaca um método para gerar organoides tumorais diretamente do tumor sem passar despercebido. Utilizando esse método, os organoides tumorais são produtíveis poucas horas após o início do procedimento e geram organoides próximos a 100% viáveis em comparação com 70% relatados na literatura31. Em comparação, outros métodos requerem a passagem em série de células em organoides ao longo ...

A capacidade de modelar células epiteliais in vitro tem sido a base da pesquisa biomédica moderna, porque captura características celulares que não são acessíveis in vivo. Por exemplo, o crescimento de linhagens celulares epiteliais em um plano bidimensional pode fornecer uma avaliação das mudanças moleculares que ocorrem em uma célula epitelial durante a proliferação1. Além disso, a mensuração da regulação dinâmica entre sinalização e expressão gênica é limitada em sistemas in vivo 2. Na pesquisa do câncer, a modelagem da linhagem celular epitelial do câncer permitiu a identificação de fatores moleculares da progressão da doença e potenciais alvos de drogas3. No entanto, o crescimento de linhagens celulares epiteliais cancerígenas em um plano bidimensional tem limitações, pois a maioria é geneticamente imortalizada e modificada, muitas vezes de natureza clonal, selecionada por sua capacidade de crescer em condições não fisiológicas, limitada em sua avaliação da arquitetura do tecido tumoral tridimensional (3D) e não modela adequadamente as interações microambientais dentro de um ambiente tecidual realista4. Essas restrições são particularmente evidentes na modelagem de metástases, que in vivo inclui vários estágios biológicos distintos, incluindo invasão, disseminação, circulação e colonização no local distante do órgão5.
Organoides epiteliais cancerígenos têm sido desenvolvidos para melhor recapitular o ambiente 3D e o comportamento dos tumores 6,7,8. Os organoides foram desenvolvidos pela primeira vez a partir de células de cripta intestinal LRG5+ únicas e diferenciados para representar a estrutura 3D de unidades cripta-vilosas que mantiveram a estrutura hierárquica do intestino delgado in vitro9. Essa abordagem permitiu a visualização e caracterização em tempo real da arquitetura de tecidos auto-organizados sob condições homeostáticas e de estresse. Como uma extensão natural, os organoides epiteliais do câncer foram desenvolvidos para modelar muitos tipos diferentes de câncer, incluindo câncer colorretal 10, pancreático 11, mama 12, fígado 13, pulmão 14, cérebro 15 e câncer gástrico 16. Organoides epiteliais oncológicos têm sido explorados para caracterizar a evolução do câncer17,18 e comportamentos espaço-temporais metastáticos19,20 e interrogar a heterogeneidade tumoral21, e testar quimioterapias 22. Organoides epiteliais do câncer também foram isolados e coletados durante ensaios clínicos em andamento para predizer a resposta do paciente a agentes anticancerígenos e radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Além disso, os sistemas que incorporam organoides epiteliais cancerígenos podem ser combinados com outras células não cancerígenas, como células imunes, para formar um modelo mais abrangente do microambiente tumoral para visualizar interações em tempo real, descobrir como as células epiteliais cancerígenas alteram a natureza fundamental das células imunes efetoras citotóxicas, como as células natural killer, e testar potenciais imunoterapias e atividade citotóxica dependente de anticorpos26, 27,28. Este artigo demonstra um método de geração de organoides epiteliais sem passar e incorporar colágeno e matriz extracelular basal (MEC). Além disso, técnicas para imagens a jusante de organoides isolados também são compartilhadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM HEPES Buffer</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Glutamax</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DMEM</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL/0.2 &#181;m filter flask</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>#564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Solution (32%)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Independent Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6546</td>
			<td>Common basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#10565-018</td>
			<td>Basal cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8662</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>#354230</td>
			<td>Basement Extracellular Matrix (BECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 N)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>SH3002701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging

Os organoides são um método confiável para modelar o tecido do órgão devido às suas propriedades auto-organizadas e retenção de função e arquitetura após a propagação do tecido primário ou células-tronco. Este método de geração de organoides renuncia à diferenciação unicelular através de múltiplas passagens e, em vez disso, usa centrifugação diferencial para isolar organoides epiteliais mamários de tecidos dissociados mecanicamente e enzimaticamente. Este protocolo fornece uma técnica simplificada para a produção rápida de organoides epiteliais pequenos e grandes a partir de tecido mamário humano e camundongo, além de técnicas para incorporação de organoides no colágeno e na matriz extracelular do porão. Além disso, instruções para fixação em gel e coloração imunofluorescente são fornecidas com a finalidade de visualizar a morfologia e a densidade organoides. Essas metodologias são adequadas para uma miríade de análises a jusante, como a co-cultura com células imunes e a modelagem de metástases ex vivo por meio de ensaio de invasão de colágeno. Essas análises servem para elucidar melhor o comportamento célula-célula e criar uma compreensão mais completa das interações dentro do microambiente tumoral.

As imagens apresentadas na Figura 1 fornecem um exemplo de organoides epiteliais mamários do tipo selvagem e tumoral de tecidos humanos e de camundongos. Uma ilustração rápida do método de isolamento de organoides epiteliais por centrifugação diferencial é fornecida no fluxo de trabalho de desenho animado na Figura 1A, mostrando que os tecidos primários de diferentes espécies podem ser processados de maneiras quase idênticas, produzindo tecido epiteli...

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Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Este protocolo discute uma abordagem para a geração de organoides epiteliais a partir de tecido mamário primário normal e tumoral através da centrifugação diferencial. Além disso, estão incluídas instruções para a cultura tridimensional, bem como imagens imunofluorescentes de organoides incorporados.

Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Este protocolo é significativo para a produção de organoides epiteliais de memória que são gerados sem passar. A principal vantagem desta técnica é que os organoides podem ser isolados do tecido mamário e de memória humana e de camundongo após a digestão enzimática. Realizamos uma série de etapas de centrifugação diferencial que isolam organoides epiteliais sem ter que passar células.Um indivíduo que realiza esta técnica pode enfrentar desafios ao incorporar os tecidos em colágeno ou matriz e chapeá-los dentro de uma placa de 96 poços. Além disso, o uso de colágeno polimerizado adequadamente e o revestimento de cúpulas estáveis é a chave para ver a invasão. Para começar, colete o tecido mamário de um rato eutanasiado jogando membros de camundongos e, usando quatro agulhas de calibre 19, prenda o rato pelas patas a uma tábua coberta com uma almofada absorvente com o lado ventral voltado para cima.Pulverize com etanol a 70% para suavizar a pele e higienizar a pele e limpar as fezes com uma gaze ou tecido. Começando logo acima da região anogenital, corte para cima a partir da linha média usando tesoura cirúrgica tomando cuidado para não perfurar o peritônio. Ao chegar ao queixo, faça cortes laterais em ambas as clavículas e nas patas traseiras e prenda a pele do rato esticada à prancha para expor as almofadas de gordura mamária.Depois de localizar as almofadas de gordura mamária inguinal e torácica em camundongos do tipo selvagem, use fórceps para elevar a almofada de gordura mamária. Usando a extremidade contundente da tesoura afiada e contundente, crie um bolso sob a almofada de gordura mamária longe da pele e corte a almofada de gordura mamária em uma peça completa. Uma vez que as almofadas de gordura mamária tenham sido removidas, enxágue em PBS antes de colocá-las em um prato de cultura de tecidos estéreis e, em seguida, transfira rapidamente para um capuz de cultura de tecidos.Pice os tumores mamários com um bisturi número 10 ou número 11 para soltar o tecido até atingir uma consistência pastosa. Transfira o tecido picado para um tubo cônico contendo 10 a 30 mililitros de solução de colagenase usando um bisturi. Para garantir que todo o tecido seja coletado, pipete um mililitro de solução de colagenase na placa de cultura de tecidos e de volta para o tubo cônico.Coloque o tubo cônico em uma incubadora de agitação de bancada até que o tecido se torne fibroso e a solução de colagenase fique turva. Gire 50 mililitros de solução por cinco a 10 minutos a 1.500 RPM. Aspirar sobrenadante e adicionar 12 mililitros do meio basal e misturar pipetando para cima e para baixo três a quatro vezes ou gire suavemente o pulso enquanto segura o tubo 15 vezes.Novamente, gire para baixo o sobrenadante aspirado, adicione o meio basal e misture por pipetagem ou rotação do tubo, conforme demonstrado anteriormente. Uma vez que os fragmentos de tecido mais pesados se depositam no fundo, colete o sobrenadante com uma pipeta sorológica e transfira-o para um tubo cônico de 15 mililitros. Após cada centrifugação, certifique-se de que o pellet se torne cada vez mais opaco.Aliquot suspensão apropriada de organoides em tubos de microcentrífuga de acordo com a densidade organoide em relação à quantidade de BECM por poço. Centrifugar os tubos de microcentrífuga durante 10 minutos a 300 G à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante dos tubos. Mova os tubos com pellets organoides para o gelo e adicione o volume apropriado de BECM a cada tubo de microcentrífuga.Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender os organoides no BECM, tomando cuidado para não produzir bolhas. Lentamente e cuidadosamente pipetar os organoides suspensos BECM na superfície de revestimento e encher todos os poços vazios com PBS para manter a umidade. Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora para permitir que o BECM solidifique e, em seguida, cubra com o volume apropriado de meio.Para preparar a solução de colágeno, combine 375 microlitros de 10 vezes a concentração de DMEM, 100 microlitros de um hidróxido de sódio normal e três mililitros de solução de colágeno I de cauda de rato em um tubo cônico de 15 mililitros. Misture a pipeta, tomando cuidado para não fazer bolhas, e titular a solução a um pH de 7,2 a 7,4 com uma pequena quantidade de hidróxido de sódio ou 10 vezes a concentração de DMEM, conforme necessário. Revestir o fundo dos poços com a quantidade mínima de colágeno necessária para cobrir totalmente o fundo do poço, colocando uma pequena quantidade de colágeno e balançar a placa de um lado para o outro.Deixe que os revestimentos de colágeno se fixem em 37 graus Celsius por 30 minutos a duas horas. Aliquotar a suspensão apropriada de organoides em tubos de microcentrífuga de acordo com a densidade organoide em relação à quantidade de colágeno por poço. Armazene a solução de colágeno a quatro graus Celsius e monitore a polimerização verificando a formação de fibras sob um microscópio a cada 10 minutos.Centrifugar os tubos de microcentrífuga a 300 G durante 10 minutos à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante dos tubos. Mova os pellets organoides para o gelo e adicione o volume apropriado de colágeno a cada tubo de microcentrífuga. Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender os organoides no colágeno, tomando cuidado para não produzir bolhas.Pipete lenta e cuidadosamente os organoides suspensos de colágeno na superfície de revestimento. As imagens imunofluorescentes de organoides embutidos na matriz extracelular basal ou colágeno foram obtidas para estudar as semelhanças de composição tecidual entre espécies. Organoides embutidos na matriz de colágeno podem ser usados para um ensaio de invasão e analisados rastreando a expansão das gavinhas que se ramificam do próprio organoide através da marcação de tomate por membrana ou coloração de faloidina da actina.Por fim, a coloração de hematoxilina e eosina de organoides embutidos em parafina mostra que os organoides mantêm a mesma histologia do câncer de mama. É crucial manter o BECM e o colágeno frios durante a pipetagem das cúpulas gelificadas para evitar a polimerização prematura. Além disso, a fixação prolongada de cúpulas em PFA levará a solução gelificada se realizar coloração imunofluorescente.Os organoides também podem ser usados em procedimentos in vitro e in vivo, como telas de drogas e modelos de metástase em camundongos. Esses métodos podem fornecer insights sobre a sensibilidade terapêutica do tecido tumoral, propriedades metastáticas e interações imunológicas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Pesquisa do câncer

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolamento de células endoteliais humanas do cólon Normal e Carcinoma colorrectal - um protocolo melhorado

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Transplante de células epiteliais mamárias no Bloco de Gordura Branca Interscapular

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Cultura, Manipulação e Transplante Ortotópico de Organoides tumorais da bexiga de camundongo

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Medição da resposta de drogas em tempo real em fatias de tecido tumoral organotípico

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Cultura e Imagem de Cortes Extraviais de Tumor Organotípico de Pseudomixoma Peritonei Ex Vivo de Espécimes Tumorais Humanos Ressecados

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In vivo Entrega de Genes em Células Epiteliais Mamárias de Camundongos Através de Injeção Intraductal Mamária

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...