Name: generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging
Uploaded: 2022-11-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging at JoVE.com

Это исследование было поддержано финансированием, предоставленным METAvivor, Фондом Питера Карлсона, Исследовательским фондом Терезы и Онкологическим центром Симмонса NCI / UTSW P30 CA142543. Мы выражаем признательность за помощь Общему ресурсу по управлению юго-западными тканями Техасского университета, общему ресурсу в Комплексном онкологическом центре Симмонса, который частично поддерживается Национальным институтом рака под номером P30 CA142543. Особая благодарность всем членам Chan Lab.

Все ткани мышей, использованные в этой рукописи, были этически собраны в соответствии с правилами и рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Юго-западного медицинского центра Техасского университета. Аналогичным образом, все пациенты д?...

<ol>
	<li>Ghandi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia.">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li><li>Roarty, K., Echeverria, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+models+for+investigating+breast+cancer+therapy+resistance+and+metastasis.">Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis.</a> Frontiers in Oncology. 11, 645698 (2021).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+New+dimensions.">Hallmarks of cancer: New dimensions.</a> Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biological+principles+of+metastasis.">Emerging biological principles of metastasis.</a> Cell. 168 (4), 670-691 (2017).</li><li>Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+organoids+for+cancer+biology+and+precision+medicine.">Applications of organoids for cancer biology and precision medicine.</a> Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Tuveson, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+modeling+meets+human+organoid+technology.">Cancer modeling meets human organoid technology.</a> Science. 364 (6444), 952-955 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorectal+tumor+organoid+library+demonstrates+progressive+loss+of+niche+factor+requirements+during+tumorigenesis.">A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity.">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+lung+cancer+organoids+as+in+vitro+cancer+models+for+therapeutic+screening.">Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening.</a> Nature Communications. 10 (1), 3991 (2019).</li><li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity.">A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li><li>Njoroge, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+model+distinct+vitamin+E+effects+at+different+stages+of+prostate+cancer+evolution.">Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16285 (2017).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Wrenn, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+collective+metastasis+by+nanolumenal+signaling.">Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling.</a> Cell. 183 (2), 395-410 (2020).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+predict+chemoradiation+responses+of+locally+advanced+rectal+cancer.">Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).</li><li>Yao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pancreas+tumor+derived+organoid+study:+from+drug+screen+to+precision+medicine.">A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 398 (2021).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Chan, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+educate+natural+killer+cells+to+a+metastasis-promoting+cell+state.">Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state.</a> Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134 (2020).</li><li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+co-culture+methods+to+capture+cancer+cell-natural+killer+cell+interactions.">Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).</li><li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+role+of+natural+killer+cells+in+cancer+metastasis.">The changing role of natural killer cells in cancer metastasis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762 (2022).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+cancer+organoids.">Next-generation cancer organoids.</a> Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Padmanaban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+culture+assays+for+murine+and+human+primary+and+metastatic-site+tumors.">Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors.</a> Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).</li></ol>

В литературе описаны различные методы получения опухолевых органоидов. В этом протоколе описывается метод получения опухолевых органоидов непосредственно из опухоли без пассажа. Используя этот метод, опухолевые органоиды могут быть получены в течение нескольких часов после начала п...

Способность моделировать эпителиальные клетки in vitro была основой современных биомедицинских исследований, поскольку она фиксирует клеточные особенности, которые недоступны in vivo. Например, выращивание эпителиальных клеточных линий в двумерной плоскости может дать оценку молекулярных изменений, происходящих в эпителиальной клетке во время пролиферации1. Кроме того, измерение динамической регуляции между передачей сигналов и экспрессией генов ограничено в системах in vivo 2. В исследованиях рака моделирование линии эпителиальных клеток рака позволило идентифицировать молекулярные драйверы прогрессирования заболевания и потенциальные мишени для лекарств3. Однако выращивание линий эпителиальных клеток рака в двумерной плоскости имеет ограничения, поскольку большинство из них генетически иммортализированы и модифицированы, часто клональны по своей природе, отобраны по их способности расти в нефизиологических условиях, ограничены в оценке трехмерной (3D) архитектуры опухолевой ткани и не адекватно моделируют взаимодействия микроокружения в реалистичной тканевой среде4. Эти ограничения особенно очевидны при моделировании метастазирования, которое in vivo включает в себя несколько различных биологических стадий, включая инвазию, распространение, циркуляцию и колонизацию в отдаленном участкеоргана 5.
Эпителиальные органоиды рака были разработаны для лучшего повторения 3D-среды и поведения опухолей 6,7,8. Органоиды были впервые разработаны из отдельных клеток кишечника LRG5+ и дифференцированы для представления 3D-структуры звеньев крипты-ворсинок, которые поддерживали иерархическую структуру тонкой кишки in vitro9. Этот подход позволил в режиме реального времени визуализировать и охарактеризовать самоорганизующуюся тканевую архитектуру в гомеостатических и стрессовых условиях. В качестве естественного расширения были разработаны органоиды эпителия рака для моделирования множества различных типов рака, включая колоректальный рак10, рак поджелудочной железы11, рак молочной железы12, печень13, легкие 14, мозг 15 и рак желудка16. Эпителиальные органоиды рака были использованы для характеристики эволюции рака17,18 и метастатического пространственно-временного поведения 19,20 и опроса гетерогенности опухоли 21 и тестирования химиотерапии 22. Раковые эпителиальные органоиды также были выделены и собраны во время текущих клинических испытаний для прогнозирования реакции пациента на противоопухолевые агенты и лучевую терапию ex vivo 8,23,24,25. Кроме того, системы, включающие раковые эпителиальные органоиды, могут быть объединены с другими нераковыми клетками, такими как иммунные клетки, для формирования более полной модели микроокружения опухоли для визуализации взаимодействий в режиме реального времени, раскрытия того, как раковые эпителиальные клетки изменяют фундаментальную природу цитотоксических эффекторных иммунных клеток, таких как естественные клетки-киллеры, и тестирования потенциальной иммунотерапии и антитело-лекарственной цитотоксической активности26, 27,28. В данной статье демонстрируется способ получения эпителиальных органоидов без пассажа и встраивания в коллаген и базальный внеклеточный матрикс (ECM). Кроме того, используются методы последующей визуализации изолированных органоидов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mM HEPES Buffer</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15240-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Glutamax</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DMEM</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL/0.2 &#181;m filter flask</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>#564-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Solution (32%)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Independent Medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6546</td>
			<td>Common basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#10565-018</td>
			<td>Basal cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#D8662</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>#15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>#354230</td>
			<td>Basement Extracellular Matrix (BECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 N)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S2770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>SH3002701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating and imaging mouse and human epithelial organoids from normal and tumor mammary tissue without passaging

Органоиды являются надежным методом моделирования ткани органа благодаря своим самоорганизующимся свойствам и сохранению функции и архитектуры после размножения из первичной ткани или стволовых клеток. Этот метод генерации органоидов отказывается от дифференцировки одноклеточных клеток через несколько пассажей и вместо этого использует дифференциальное центрифугирование для выделения органоидов эпителия молочной железы из механически и ферментативно диссоциированных тканей. Этот протокол обеспечивает оптимизированную технику быстрого получения мелких и крупных эпителиальных органоидов как из ткани молочной железы мыши, так и из ткани молочной железы человека в дополнение к методам встраивания органоидов в коллаген и базис внеклеточного матрикса. Кроме того, приведены инструкции по фиксации в геле и иммунофлуоресцентному окрашиванию с целью визуализации морфологии и плотности органоидов. Эти методологии подходят для множества последующих анализов, таких как совместное культивирование с иммунными клетками и моделирование метастазов ex vivo с помощью анализа инвазии коллагена. Эти анализы служат для лучшего выяснения поведения клеток и создания более полного понимания взаимодействий в микроокружении опухоли.

Изображения, представленные на рисунке 1, представляют собой пример эпителиальных органоидов эпителия молочной железы дикого типа из тканей человека и мыши. Краткая иллюстрация метода выделения эпителиальных органоидов с помощью дифференциального центрифугирования ...

Watch this Scientific Journal Video about Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging at JoVE.com

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

В этом протоколе обсуждается подход к получению эпителиальных органоидов из первичной нормальной и опухолевой ткани молочной железы посредством дифференциального центрифугирования. Кроме того, включены инструкции по трехмерному культивированию, а также иммунофлуоресцентной визуализации встроенных органоидов.

Генерация и визуализация эпителиальных органоидов мыши и человека из нормальной и опухолевой ткани молочной железы без пассажа

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Этот протокол важен для производства эпителиальных органоидов памяти, которые генерируются без пассажа. Основное преимущество этого метода заключается в том, что органоиды могут быть выделены из ткани молочной железы и памяти человека и мыши после ферментативного пищеварения. Мы выполняем серию этапов дифференциального центрифугирования, которые изолируют эпителиальные органоиды без необходимости прохождения клеток.Человек, выполняющий эту технику, может столкнуться с проблемами при встраивании тканей в коллаген или матрикс и нанесении их на 96-луночную пластину. Кроме того, использование правильно полимеризованного коллагена и покрытие стабильных куполов является ключом к обнаружению вторжения. Для начала соберите ткань молочной железы усыпленной мыши, растопырив конечности мыши и используя четыре иглы 19 калибра, прикрепите мышь за лапы к доске, покрытой впитывающей прокладкой брюшной стороной вверх.Сбрызните 70% этанолом, чтобы разгладить шерсть и продезинфицировать кожу, а также вытрите фекалии марлевой салфеткой или салфеткой. Начиная чуть выше аногенитальной области, разрежьте вверх от средней линии хирургическими ножницами, стараясь не проткнуть брюшину. Достигнув подбородка, сделайте боковые надрезы вниз по обеим ключицам и вниз по задним лапам и прижмите натянутую кожу мыши к доске, чтобы обнажить жировые подушечки молочной железы.После обнаружения паховых и грудных жировых подушечек молочной железы у мышей дикого типа используйте щипцы, чтобы поднять жировую подушку молочной железы. Используя тупой конец острых тупых ножниц, создайте карман под жировой подушкой молочной железы подальше от кожи и отрежьте жировую подушечку молочной железы одним целым куском. После удаления жировых отложений молочной железы промойте их в PBS перед помещением в стерильную чашку для культивирования тканей, а затем быстро перенесите в капюшон для культивирования тканей.Измельчите опухоли молочной железы скальпелем No 10 или No 11, чтобы ослабить ткань, пока она не достигнет пастообразной консистенции. Переведите измельченную ткань в коническую трубку, содержащую от 10 до 30 миллилитров раствора коллагеназы, с помощью скальпеля. Чтобы убедиться, что вся ткань собрана, пипеткой нанесите один миллилитр раствора коллагеназы на пластину для культивирования тканей и обратно в коническую трубку.Поместите коническую трубку в настольный встряхивающий инкубатор до тех пор, пока ткань не станет волокнистой, а раствор коллагеназы не помутнеет. Отварите 50 миллилитров раствора в течение пяти-10 минут при 1 500 об/мин. Вдохните надосадочную жидкость, добавьте 12 миллилитров базальной среды и перемешайте, пипеткой вверх и вниз три-четыре раза или осторожно поверните запястье, удерживая трубку 15 раз.Опять же, открутите надосадочную жидкость аспирата, добавьте базальную среду и перемешайте пипеткой или вращением трубки, как показано ранее. Как только самые тяжелые фрагменты ткани осядут на дно, соберите надосадочную жидкость серологической пипеткой и перенесите ее в коническую трубку объемом 15 миллилитров. После каждого центрифугирования следите за тем, чтобы гранулы становились все более непрозрачными.Аликвота соответствующая суспензия органоидов в микроцентрифужные пробирки в соответствии с плотностью органоидов по отношению к количеству BECM на лунку. Центрифугируйте микроцентрифужные пробирки в течение 10 минут при 300 G при комнатной температуре и выбрасывайте надосадочную жидкость из пробирок. Переместите пробирки с органоидными гранулами на лед и добавьте соответствующий объем BECM в каждую микроцентрифужную пробирку.Аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы ресуспендировать органоиды в BECM, стараясь не образовывать пузырьков. Медленно и осторожно нанесите взвешенные органоиды BECM на поверхность покрытия пипеткой и заполните все пустые лунки PBS для поддержания влажности. Поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на один час, чтобы дать BECM затвердеть, а затем накройте средой соответствующего объема.Чтобы приготовить раствор коллагена, смешайте 375 микролитров с концентрацией в 10 раз превышающей концентрацию DMEM, 100 микролитров одного нормального гидроксида натрия и три миллилитра раствора коллагена I крысиного хвоста в конической трубке объемом 15 миллилитров. Пипетку перемешайте, стараясь не образовывать пузырьков, и титруйте раствор до рН от 7,2 до 7,4 с небольшим количеством гидроксида натрия или концентрацией ДМЭМ, в 10 раз превышающей концентрацию ДМЭМ по мере необходимости. Покройте дно лунок минимальным количеством коллагена, необходимым для полного покрытия дна лунки, поместив небольшое количество коллагена, и раскачивайте пластину из стороны в сторону, чтобы покрыть.Дайте коллагеновой подложке застыть при температуре 37 градусов по Цельсию в течение от 30 минут до двух часов. Аликвотировать соответствующую суспензию органоидов в микроцентрифужные пробирки в соответствии с плотностью органоидов по отношению к количеству коллагена в лунке. Храните раствор коллагена при четырех градусах Цельсия и контролируйте полимеризацию, проверяя образование волокон под микроскопом каждые 10 минут.Центрифугируют микроцентрифужные пробирки при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре и выбрасывают надосадочную жидкость из пробирок. Переместите гранулы органоидов в лед и добавьте соответствующий объем коллагена в каждую микроцентрифужную пробирку. Осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы ресуспендировать органоиды в коллагене, стараясь не образовывать пузырьков.Медленно и осторожно нанесите суспендированные органоиды коллагена пипеткой на поверхность покрытия. Иммунофлуоресцентные изображения встроенных органоидов в базальном внеклеточном матриксе или коллагене были получены для изучения сходства межвидового состава тканей. Органоиды, встроенные в коллагеновую матрицу, могут быть использованы для анализа инвазии и проанализированы путем отслеживания расширения усиков, ответвляющихся от самого органоида, либо через мембранную маркировку томатов, либо через окрашивание актина фаллоидином.Наконец, окрашивание гематоксилином и эозином органоидов, встроенных в парафин, показывает, что органоиды сохраняют ту же гистологию рака молочной железы. Крайне важно, чтобы BECM и коллаген оставались холодными во время пипетки гелеобразных куполов, чтобы избежать преждевременной полимеризации. Кроме того, длительная фиксация куполов в PFA приведет к образованию гелеобразного раствора при выполнении иммунофлюоресцентного окрашивания.Органоиды также могут быть использованы в процедурах in vitro и in vivo, таких как скрининг лекарств и мышиные модели метастазирования. Эти методы могут дать представление о терапевтической чувствительности опухолевой ткани, метастатических свойствах и иммунных взаимодействиях.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Радионуклида флуоресценции Репортер ген Imaging для отслеживания опухолевой прогрессии в моделях грызунов опухоли

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Изоляция эндотелиальных клеток человека от обычной толстой кишки и колоректальный рак - улучшение протокол

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Крыса молочной эпителиальной трансплантации клеток в межлопатулярный белый жир Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Культура, манипуляция и ортотопическая трансплантация органов опухолевых опухолей мышелового пузыря

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Измерение в режиме реального времени ответ на наркотики в органотипической опухоли ткани фрагменты

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Оценка онкогенной трансформации в эпителиальных клетках молочной железы человека

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Подход к сегментации без меток для прижизненной визуализации микроокружения опухоли молочной железы

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Культура и визуализация органотипических срезов опухоли псевдомиксомы брюшины ex vivo из резецированных образцов опухолей человека

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

В естественных условиях Доставка генов в эпителиальные клетки молочной железы мыши посредством внутрипротоковой инъекции молочной железы

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Опухолевые органоиды и фибробласты, полученные из рака поджелудочной железы из свежих тканей

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

В центре внимания автора: Создание опухолевых органоидов и фибробластов, полученных из рака поджелудочной железы, из свежих тканей  

Получение опухолевых органоидов и фибробластов рака поджелудочной железы из свежих тканей

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...