Detta protokoll innefattar testning av antibakteriell effekt i realtid av antibiotika som eluerats frÄn en polymeranordning, vilket kan hjÀlpa till att exakt bestÀmma effektiva formuleringar som ökar deras translationella vÀrde. Denna metod möjliggör antibakteriell effektivitetstestning i realtid för att övervaka den longitudinella aktiviteten hos lÀkemedelseluerande material och för att förstÄ intervallet av antibakteriell aktivitet för en given implantatformulering. Detta polymera material anvÀnds i över 90% av de totala fogbytena som lageryta.
Och dessa antibiotika-eluerande formuleringar av det utvecklas som möjliga behandlingar för periprostetiska ledinfektioner. Denna metod kan anvÀndas med vilken lÀkemedelselueringsanordning som helst, sÄsom porösa metaller, nedbrytbara och icke-nedbrytbara polymerer, geler och eventuellt partikelformiga material med materialspecifika protokollÀndringar. Börja med att odla bakterierna över natten i en milliliter tryptisk sojabuljong.
SpÀd sedan den över natten odlade bakteriesuspensionen i steril Mueller Hinton Broth, eller MHB, och verifiera det livskraftiga bakterieantalet med hjÀlp av luminiscensenheterna före experimentets början enligt beskrivningen i manuskriptet. Placera de jungfruliga och lÀkemedelsladdade UHMWPE-remsorna i en tre-milliliter spruta. Dra sedan MHB-innehÄllande bakteriesuspension i sprutan genom den bifogade nÄlen upp till 1,5 milliliter-mÀrket.
Placera sprutuppsÀttningen pÄ en skakande inkubator tills de angivna tidpunkterna pÄ sex timmar och sedan varje dag fram till dag sju. Efter varje angiven tidpunkt, ta ut sprutinstÀllningen och fördela mediet i ett tvÄ-milliliter rör. Utför en realtidsanalys av mikrobiell viabilitet enligt beskrivningen i manuskriptet med 100 mikroliter bakteriesuspension.
Efter bestÀmning av antalet livskraftiga bakterier, berÀkna de kolonibildande enheterna per milliliter frÄn luminiscensenheterna med motsvarande standardkurva. För att verifiera frÄnvaron av livskraftiga bakterier i proverna som visade luminiscensvÀrden under detektionsgrÀnsen, sprida kulturen pÄ tryptiska sojaagarplattor. Inkubera plattorna vid 35 grader Celsius över natten.
Kontrollera sedan nÀrvaron av kolonier nÀsta dag. Centrifugera den ÄterstÄende bakteriesuspensionen. Aspirera försiktigt det anvÀnda mediet.
LÀmna 100 mikroliter supernatant i rören med osynliga pellets. Resuspendera de pelleterade bakterierna i fÀrskt MHB. Virvel i 10 sekunder för att sÀkerstÀlla fullstÀndig resuspension.
Dra sedan bakteriesuspensionen i samma sprutuppsĂ€ttning genom den bifogade nĂ„len. Börja med att hĂ€mta jungfruliga och lĂ€kemedelsladdade UHMWPE-ytor frĂ„n sprutuppsĂ€ttningen efter avslutad studie pĂ„ dag sju. Ăverför sedan ytorna till 1,5 ml rör och skölj med en milliliter steril PBS tre gĂ„nger.
Sonicate ytan i 40 minuter i en milliliter steril PBS. BestÀm vidhÀftande bakterier livskraft genom att utföra en luminescera analys pÄ 100 mikroliter av sonicated provet. LÀkemedelsfrisÀttningen frÄn vankomycin och gentamicinladdad UHMWPE visade en burstfrisÀttning vid sex timmar följt av en stadig frisÀttningshastighet med en koncentration större Àn den minsta hÀmmande koncentrationen fram till sju dagar.
UHMWPE med vankomycin och gentamicin visade mer Àn tre log-reduktion för mottaglig ATCC 12600 med början efter sex timmar och fullstÀndig utrotning observerades vid dag tre. För den gentamicinkÀnsliga och vankomycinintermediÀra stammen, L1163, orsakade bÄda lÀkemedelseluerande material mer Àn tre logreduktioner efter sex timmar och ingen kolonitillvÀxt observerades dag ett. Gentamicineluering frÄn UHMWPE pÄverkade inte bakteriell viabilitet hos den gentamicinresistenta och vankomycin-intermediÀra stammen, L1101.
TvÀrtom minskade vankomycineluering frÄn UHMWPE signifikant bakteriell livskraft vid sex timmar. Ytorna pÄ bÄde gentamicin och vankomycineluerande UHMWPE visade inga livskraftiga vidhÀftande bakterier nÀr de utsattes för kÀnsliga och intermediÀra resistensstammar efter dag sju. Vissa livskraftiga bakterier fanns dock pÄ gentamicineluerande UHMWPE exponerade för gentamicinresistent L1101.
Ytan pÄ kontrolljungfrulig polyeten visade livskraftiga vidhÀftande bakterier nÀr de utsattes för varje stam. Separationen av anvÀnda medier vid varje tidpunkt, vilket underlÀttar överföring av den mikrobiella befolkningen, Àr avgörande för att simulera den ihÄllande exponeringen för antibiotika. Samtidigt som en förbÀttring av statiska metoder kan denna semistatiska simuleringsmetod följas upp med en kontinuerlig instÀllning för att ytterligare förstÄ aktivitetskinetiken för nya lÀkemedelsformuleringar mot infektioner.
Protokollet har gjort det möjligt för oss att fÄnga effekten av lÀkemedelseluering pÄ stamberoende bakteriedynamik. Det förbÀttrar verktygen för effektivitetsutvÀrdering av ihÄllande antibiotikaleveransanordningar.