En ny metod för att bestämma den longitudinella antibakteriella aktiviteten hos läkemedelseluerande material

Detta protokoll innefattar testning av antibakteriell effekt i realtid av antibiotika som eluerats från en polymeranordning, vilket kan hjälpa till att exakt bestämma effektiva formuleringar som ökar deras translationella värde. Denna metod möjliggör antibakteriell effektivitetstestning i realtid för att övervaka den longitudinella aktiviteten hos läkemedelseluerande material och för att förstå intervallet av antibakteriell aktivitet för en given implantatformulering. Detta polymera material används i över 90% av de totala fogbytena som lageryta.

Och dessa antibiotika-eluerande formuleringar av det utvecklas som möjliga behandlingar för periprostetiska ledinfektioner. Denna metod kan användas med vilken läkemedelselueringsanordning som helst, såsom porösa metaller, nedbrytbara och icke-nedbrytbara polymerer, geler och eventuellt partikelformiga material med materialspecifika protokolländringar. Börja med att odla bakterierna över natten i en milliliter tryptisk sojabuljong.

Späd sedan den över natten odlade bakteriesuspensionen i steril Mueller Hinton Broth, eller MHB, och verifiera det livskraftiga bakterieantalet med hjälp av luminiscensenheterna före experimentets början enligt beskrivningen i manuskriptet. Placera de jungfruliga och läkemedelsladdade UHMWPE-remsorna i en tre-milliliter spruta. Dra sedan MHB-innehållande bakteriesuspension i sprutan genom den bifogade nålen upp till 1,5 milliliter-märket.

Placera sprutuppsättningen på en skakande inkubator tills de angivna tidpunkterna på sex timmar och sedan varje dag fram till dag sju. Efter varje angiven tidpunkt, ta ut sprutinställningen och fördela mediet i ett två-milliliter rör. Utför en realtidsanalys av mikrobiell viabilitet enligt beskrivningen i manuskriptet med 100 mikroliter bakteriesuspension.

Efter bestämning av antalet livskraftiga bakterier, beräkna de kolonibildande enheterna per milliliter från luminiscensenheterna med motsvarande standardkurva. För att verifiera frånvaron av livskraftiga bakterier i proverna som visade luminiscensvärden under detektionsgränsen, sprida kulturen på tryptiska sojaagarplattor. Inkubera plattorna vid 35 grader Celsius över natten.

Kontrollera sedan närvaron av kolonier nästa dag. Centrifugera den återstående bakteriesuspensionen. Aspirera försiktigt det använda mediet.

Lämna 100 mikroliter supernatant i rören med osynliga pellets. Resuspendera de pelleterade bakterierna i färskt MHB. Virvel i 10 sekunder för att säkerställa fullständig resuspension.

Dra sedan bakteriesuspensionen i samma sprutuppsättning genom den bifogade nålen. Börja med att hämta jungfruliga och läkemedelsladdade UHMWPE-ytor från sprutuppsättningen efter avslutad studie på dag sju. Överför sedan ytorna till 1,5 ml rör och skölj med en milliliter steril PBS tre gånger.

Sonicate ytan i 40 minuter i en milliliter steril PBS. Bestäm vidhäftande bakterier livskraft genom att utföra en luminescera analys på 100 mikroliter av sonicated provet. Läkemedelsfrisättningen från vankomycin och gentamicinladdad UHMWPE visade en burstfrisättning vid sex timmar följt av en stadig frisättningshastighet med en koncentration större än den minsta hämmande koncentrationen fram till sju dagar.

UHMWPE med vankomycin och gentamicin visade mer än tre log-reduktion för mottaglig ATCC 12600 med början efter sex timmar och fullständig utrotning observerades vid dag tre. För den gentamicinkänsliga och vankomycinintermediära stammen, L1163, orsakade båda läkemedelseluerande material mer än tre logreduktioner efter sex timmar och ingen kolonitillväxt observerades dag ett. Gentamicineluering från UHMWPE påverkade inte bakteriell viabilitet hos den gentamicinresistenta och vankomycin-intermediära stammen, L1101.

Tvärtom minskade vankomycineluering från UHMWPE signifikant bakteriell livskraft vid sex timmar. Ytorna på både gentamicin och vankomycineluerande UHMWPE visade inga livskraftiga vidhäftande bakterier när de utsattes för känsliga och intermediära resistensstammar efter dag sju. Vissa livskraftiga bakterier fanns dock på gentamicineluerande UHMWPE exponerade för gentamicinresistent L1101.

Ytan på kontrolljungfrulig polyeten visade livskraftiga vidhäftande bakterier när de utsattes för varje stam. Separationen av använda medier vid varje tidpunkt, vilket underlättar överföring av den mikrobiella befolkningen, är avgörande för att simulera den ihållande exponeringen för antibiotika. Samtidigt som en förbättring av statiska metoder kan denna semistatiska simuleringsmetod följas upp med en kontinuerlig inställning för att ytterligare förstå aktivitetskinetiken för nya läkemedelsformuleringar mot infektioner.

Protokollet har gjort det möjligt för oss att fånga effekten av läkemedelseluering på stamberoende bakteriedynamik. Det förbättrar verktygen för effektivitetsutvärdering av ihållande antibiotikaleveransanordningar.