Name: antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for specific detection of mycoplasma pneumoniae
Uploaded: 2023-02-24T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae at JoVE.com

تم تمويل هذه الدراسة من قبل وزارة الصحة التونسية ووزارة التعليم العالي والبحث العلمي التونسية.

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للجوانب الأخلاقية التي وضعتها اللجنة الأخلاقية لمعهد باستور بتونس.
1. خطوات ما قبل ELISA: المتطلبات الأساسية والمعالجة المسبقة
<ol><li>السلالات البكتيرية ووسائط النمو ملاحظة: يتم سرد أنواع Mollicutes والبكتيريا المسورة المستخدمة في هذه الدراسة ...

<ol>
	<li>Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+and+pathogenicity+of+mycoplasmas.">Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).</li><li>Chanock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+infections+of+man.">Mycoplasma infections of man.</a> The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).</li><li>Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+pneumoniae:+Usual+suspect+and+unsecured+diagnosis+in+the+acute+setting.">Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting.</a> The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).</li><li>Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cytadhesion+of+Mycoplasma+pneumoniae.">Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae.</a> Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).</li><li>Waldo, R. H., Krause, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+stability,+and+function+of+cytadhesin+P1+and+accessory+protein+B/C+complex+of+Mycoplasma+pneumoniae.">Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae.</a> Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).</li><li>Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+pathogenesis+and+detection+of+Mycoplasma+pneumoniae+infections.">New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections.</a> Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).</li><li>Narita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+extrapulmonary+manifestations+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection+with+special+reference+to+pneumonia.">Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).</li><li>Kashyap, S., Sarkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+pneumonia:+Clinical+features+and+management.">Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management.</a> Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).</li><li>Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+versus+serology+for+diagnosing+Mycoplasma+pneumoniae+infection:+A+systematic+review+&amp;+meta-analysis.">PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review &amp; meta-analysis.</a> Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).</li><li>Saraya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+pneumoniae+infection:+Basics.">Mycoplasma pneumoniae infection: Basics.</a> Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).</li><li>Jacobs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infections:+a+critical+review+of+current+procedures.">Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures.</a> Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).</li><li>Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection:+3.+Detection+of+IgM+antibodies+to+M.+pneumoniae+by+a+modified+indirect+haemagglutination+test.">Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test.</a> Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).</li><li>Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+pneumoniae+infections:+diagnosis+based+on+immunofluorescence+titer+of+IgG+and+IgM+antibodies.">Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).</li><li>Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+detection+of+Mycoplasma+pneumoniae+antibodies.">Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).</li><li>Van Griethuysen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+the+early+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection.">Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection.</a> European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).</li><li>Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection+by+enzyme+immunoassay.">Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay.</a> Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).</li><li>Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+cross-reactive+antibodies+to+mycoplasmas+in+human+sera+by+ELISA+and+immunoblotting.">Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting.</a> Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).</li><li>Brunner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpectedly+high+frequency+of+antibody+to+Mycoplasma+pneumoniae+in+human+sera+as+measured+by+sensitive+techniques.">Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques.</a> Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).</li><li>Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+analysis+of+Mycoplasma+pneumoniae:+3.+Separation+and+chemical+identification+of+serological+active+lipids.">Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids.</a> Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).</li><li>Ponka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+and+clinical+picture+of+serologically+verified+Mycoplasma+pneumoniae+infections+with+emphasis+on+central+nervous+system,+cardiac+and+joint+manifestations.">The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations.</a> Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets.+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications.</a> Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+detection+of+avian+mycoplasmas+in+culture.">An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture.</a> Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).</li><li>Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adsorption+procedure+to+increase+the+specificity+of+enzyme-linked+immunosorbent+assays+for+lyme+disease+without+decreasing+sensitivity.">An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity.</a> Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).</li><li>Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+and+treatment+of+mycoplasmal+infections.">The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections.</a> Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).</li><li>Meyer, R. D., Clough, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extragenital+Mycoplasma+hominis+infections+in+adults:+emphasis+on+immunosuppression.">Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression.</a> Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).</li><li>Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+host+specificity:+Fact+or+fiction.">Mycoplasma host specificity: Fact or fiction.</a> Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).</li><li>Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+lipofaciens+transmission+to+veterinarian.">Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).</li><li>Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mycoplasma+species+from+a+patient+with+seal+finger.">Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger.</a> Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).</li><li>Slack, M., P, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+role+of+Haemophilus+influenzae+in+community-acquired+pneumonia.">A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia.</a> Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).</li><li>Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+Streptococcus+pyogenes:+public+health+risk+factors,+prevention+and+control.">A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control.</a> Pathogens. 10 (2), 248 (2021).</li><li>Steinitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+the+blocking+effect+of+Tween+20+and+bovine+serum+albumin+in+ELISA+microwells.">Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells.</a> Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).</li><li>Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+mycoplasmas:+cultivation+and+vertebrate+pathogenicity+of+a+new+spiroplasma.">Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma.</a> Science. 195 (4281), 892-894 (1977).</li><li>Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+medium+for+the+isolation+of+avian+mycoplasmas.">A medium for the isolation of avian mycoplasmas.</a> American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli.">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li></ol>

تقدم هذه الورقة وصفا عاما ل ELISA الداخلي الذي تم تطويره بشكل أساسي لضمان فحص محدد ل M. pneumoniae عدوى. يتم توفير تفاصيل حول بروتوكول اختبار ELISA نفسه بالإضافة إلى بعض خطوات المعالجة السابقة واللاحقة. يتم ضمان خصوصية هذا الفحص من خلال تقنية الامتزاز. تم وصف هذا الإجراء سابقا في اختبارات ELISA الت?...

الميكوبلازما هي من بين أصغر وأبسط بدائيات النوى المعروفة. تتميز بشكل أساسي عن البكتيريا الأخرى بعدم وجود بنية جدار الخلية. وهكذا ، تم تصنيف الميكوبلازما في فئة منفصلة تسمى Mollicutes1. يمنح نقص جدار الخلية مقاومة جوهرية لهذه الكائنات الحية الدقيقة ضد بعض العوامل المضادة للميكروبات وهو مسؤول إلى حد كبير عن تعدد أشكالها. الميكوبلازما لها جينوم صغير وحجم منخفض ، مما يحد من قدراتها الأيضية والاصطناعية الحيوية ويفسر طبيعتها الطفيلية والرمية1.
الميكوبلازما الرئوية هي واحدة من الميكوبلازما التي تصيب الإنسان ويعتقد أنها الأكثر ضراوة2. يستعمر المتفطرة الرئوية الجهاز التنفسي العلوي ، مما يؤدي إلى التهاب رئوي غير نمطي لدى الأطفال والشباب. العلامات السريرية الناتجة عن عدوى المتفطرة الرئوية تشبه الأنفلونزا ، مع الصداع والحمى والسعال3. يتم التوسط في الالتصاق الخلوي للمتفطرة الرئوية بالخلايا المضيفة بواسطة عضية مرفقة بما في ذلك الالتصاق P1 الرئيسي والعديد من البروتينات الملحقة 4,5. قد تحدث المزيد من المظاهر السريرية بسبب الالتهاب الموضعي وتحفيز الجهاز المناعي المضيف الناتج عن الالتزام الحميم للمتفطرة الرئوية بالغشاء المخاطي في مجرى الهواء6. على الرغم من أن الالتهاب الرئوي هو السمة المميزة لعدوى M. pneumoniae ، فقد تم الكشف عن أن العدوى بهذه البكتيريا يمكن أن تكون مسؤولة أيضا عن مجموعة واسعة من المظاهر غير الرئوية في مواقع تشريحية مختلفة مثل الجهاز العصبي المركزي والقلب والجلد والمفاصل7.
كما هو الحال بالنسبة لجميع أنواع الميكوبلازما ، فإن تشخيص المتفطرة الرئوية يمثل تحديا. العلامات السريرية التي تثير الميكوبلازما هي في الغالب غير واضحة وغير مميزة8. نظرا لأنه من الصعب جدا تشخيص عدوى المتفطرة الرئوية بالاعتماد فقط على المظاهر والأعراض السريرية ، فإن الفحص المختبري له أهمية خاصة9. الكشف عن مستعمرات المتفطرة الرئوية عن طريق الثقافة هو الطريقة القياسية الذهبية للتشخيص المناسب. ومع ذلك ، فإن متطلبات النمو السريعة والوقت الطويل اللازم لتقديم نتائج نهائية (1-2 أسابيع) تعقد الثقافة ، وبالتالي تعني أنها نادرا ما تستخدم للتشخيص الروتيني10. تم التحقق من صحة تقنيات تضخيم الحمض النووي من حيث السرعة والكفاءة ، على الرغم من أنها لا تعتبر اختبارات تشخيصية من الدرجة الأولى بسبب تكلفتها العالية نسبيا وعدم توفرها في بعض مرافق الرعاية الصحية. صحيح أن اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل التجارية تستخدم على نطاق واسع لتشخيص عدوى المتفطرة الرئوية ، لكنها لا تزال غير قادرة على استبدال الأمصال. أيضا ، أدى الحدوث المتكرر لكل من النتائج السلبية والإيجابية الخاطئة إلى الحد من استخدام PCR9. وبشكل روتيني، يظل علم الأمصال هو الأكثر ممارسة في المختبرات لتشخيص عدوى المتفطرة الرئوية. تم الإبلاغ عن العديد من مناهج الأمصال لعقود ، مثل الهيماجلوتينين البارد ، واختبار التثبيت المتمم 11 ، واختبار التراص الدموي غير المباشر 12 ، والتألق المناعي13 ، وتقنية ELISA ، التي تم تطبيقها لأول مرة على الأمصال الميكوبلازما في أوائل عام 198014،15،16. واحدة من القضايا الرئيسية التي واجهتها عند إجراء التشخيص المصلي ELISA لعدوى المتفطرة الرئوية هي ردود الفعل المتقاطعة ، مما يقلل بشكل كبير من خصوصية التقنية. تم الإبلاغ سابقا عن امتزاز غير محدد للأمصال البشرية مع مستضدات M. pneumoniae. في الواقع ، قد لا تكون العديد من الأجسام المضادة التي اكتشفتها ELISA في الأمصال البشرية مرتبطة دائما بمستضدات الميكوبلازم 17 ، بسبب القواسم المشتركة بين M. pneumoniae مع بعض البكتيريا18,19 وبعض الأنسجة الحيوانية والبشرية20.
بسبب القراءات الخلفية العالية التي لوحظت في اختبار ELISA التقليدي الذي كان يمارس في المختبر ، كان تفسير النتائج معقدا في كثير من الأحيان ، وبالتالي كان تقديم التشخيص المناسب للمتفطرة الرئوية مهمة صعبة. أثناء مواجهة هذه المشكلة ، اخترنا تحسين M. pneumoniae ELISA عن طريق إزالة التفاعلات غير المحددة لمستضدات M. pneumoniae مع الأجسام المضادة المراد اختبارها. لهذا الغرض ، عملنا على الاستنفاد الانتقائي لمستضدات M. pneumoniae غير المحددة باستخدام تقنية الامتزاز. في الواقع ، فإن الهدف الرئيسي من ELISA الذي يلتقط المستضد هو الكشف على وجه التحديد عن الغلوبولين المناعي الرئوي (Ig) G في عينات المصل البشري. يتكون مفهوم ELISA هذا بشكل أساسي من الالتقاط الانتقائي لمستضدات M. pneumoniae الخاصة ، قبل إضافة عينات المصل البشري. يتم تأمين هذه الانتقائية عن طريق احتضان مستضد M. pneumoniae الخام مع مصل مضاد متعدد النسيلة M. pneumoniae ، يتم إنتاجه في الأرانب في المختبر وجعله خاصا بالأنواع عن طريق الامتزاز ضد مجموعة من البكتيريا غير المتجانسة ، التي تنتمي أو لا تنتمي إلى فئة Mollicutes ، وتشارك المستضدات مع M . pneumoniae الأنواع و / أو المعروف أنها تستعمر الجهاز التنفسي. تم تكرار إجراء الامتزاز ثلاث مرات ، وتم اختبار كفاءته للقضاء على التفاعل المتبادل عن طريق النشاف المناعي. مقايسة ELISA المطورة هي مزيج من الساندويتش و ELISA غير المباشر. باختصار ، يتم طلاء آبار صفيحة ELISA أولا بمصل مضاد متعدد النسيلة خاص ب M. pneumoniae. بعد ذلك ، يضاف مستضد M. pneumoniae ويحبس بين المصل المضاد والأجسام المضادة الموجودة في عينة المصل المراد اختبارها. يتم الكشف عن المركب المناعي المتشكل بواسطة جسم مضاد ثانوي مقترن بالإنزيم (IgG المترافق البيروكسيداز). يتم تصور التفاعلات عن طريق إضافة الركيزة الكروموجينية ، ويتم قياس الامتصاص طيفيا. يتم تقديم ELISA الداخلي هذا بشكل تخطيطي في الشكل 1. أثبت ELISA محلي الصنع فعاليته في الكشف عن عدوى المتفطرة الرئوية على وجه التحديد وهو حاليا أحد أكثر الاختبارات ممارسة في النشاط التشخيصي الروتيني.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-chloro-1-naphtol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6788-50 TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50 Cap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL1066&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0058-N1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco PPLO Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>255420</td>
			<td>Frey media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate-Reader</td>
			<td>MULTISKAN GO, Thermo Scientific</td>
			<td>Ref: 51119200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>FBS-12A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>656120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid 37%</td>
			<td>Prolab</td>
			<td>2025.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>HI01361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Prepared in Pasteur Institute of Tunis</td>
			<td></td>
			<td>Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit</td>
			<td>Produced in Pasteur Institute of Tunis</td>
			<td></td>
			<td>Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7004-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium (1 MIU)</td>
			<td>PANPHARMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>fluka chemika</td>
			<td>77660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>902887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Novachim</td>
			<td>PS02805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1007311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal</td>
			<td>USB</td>
			<td>22215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB substrate (3,3&#8217;, 5,5&#8217; TetraMethyl-Benzidine solution)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6791-1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1379-500 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract, powder, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J23547&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for specific detection of mycoplasma pneumoniae

الميكوبلازما الرئوية هي بدائية النواة التي تعاني من نقص جدار الخلية ، والمعروفة أساسا باستعمار الجهاز التنفسي البشري وأنها مستوطنة ، مع ذروة وبائية كل 6 سنوات ، في الأطفال الأكبر سنا والشباب. يمثل تشخيص المتفطرة الرئوية تحديا بسبب الطبيعة السريعة للممرض وإمكانية النقل بدون أعراض. لا يزال التشخيص المختبري لعدوى المتفطرة الرئوية على أساس معايرة الأجسام المضادة في عينات مصل المرضى هو الطريقة الأكثر ممارسة. بسبب المشكلة المحتملة للتفاعل المناعي المتبادل مع استخدام مصل متعدد النسيلة للمتفطرة الرئوية ، تم تطوير مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد (ELISA) لتحسين خصوصية التشخيص المصلي. يتم طلاء صفائح ELISA بأجسام مضادة متعددة النسيلة M. pneumoniae ، يتم تربيتها في الأرانب وتصبح محددة بعد الامتزاز ضد مجموعة من البكتيريا غير المتجانسة التي تشترك في المستضدات مع أنواع M. pneumoniae و / أو من المعروف أنها تستعمر الجهاز التنفسي . ثم يتم التعرف على المستضدات المتماثلة المتفاعلة M. pneumoniae على وجه التحديد من خلال الأجسام المضادة المقابلة لها في عينات المصل. أدى المزيد من التحسين للمعلمات الفيزيائية والكيميائية التي يتعرض لها ELISA لالتقاط المستضد إلى ELISA محدد للغاية وحساس وقابل للتكرار.

نشاط النشاف المناعي لمصل الميكوبلازما الرئوية متعدد النسيلة غير الممتز للبكتيريا غير المتجانسة التفاعل المتقاطع موجود بالفعل كما هو موضح في نتائج النشاف المناعي (الشكل 2) ومقارنة بالتحكم الإيجابي (الممر 1) ، تتم مشاركة بعض مستضدات M. pneu...

Watch this Scientific Journal Video about Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae at JoVE.com

Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae

في عدوى الميكوبلازما الرئوية ، يمكن أن تؤدي اختبارات الأمصال إلى نتائج جيدة ، ولكن مع خصوصية منخفضة بسبب التفاعل المتقاطع المناعي. يضمن ELISA الذي يلتقط المستضد الداخلي ، الموصوف في هذه الورقة ، خصوصية عالية للأنواع وقد ثبت أنه اختبار فحص موثوق به للتشخيص الدقيق للمتفطرة الرئوية.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد للكشف المحدد عن الميكوبلازما الرئوية

Mycoplasma pneumoniae is a cell wall-deficient prokaryote, mainly known to colonize the human respiratory tract and to be endemic, with epidemic peaks ...

أما بالنسبة لجميع مرضى الميكوبلازم ، فإن تشخيصهم بالميكوبلازم الرئوي يمثل تحديا بسبب ردود الفعل المتقاطعة. يعتمد ELISA المقترح لدينا على الاستنفاد الانتقائي لمستضدات الميكوبلازم الرئوية غير المحددة باستخدام تقنية الامتزاز. يضمن التقاط المستضد الداخلي ELISA الموصوف في هذا الفيديو خصوصية واسعة عالية.وفي الواقع ، لقد ثبت أنه اختبار فحص موثوق به لتشخيص دقيق لعدوى الميكوبلازم الرئوية. ستوضح خطوات ما قبل ELISA إيمان شنيبا ، طالبة دكتوراه. وستكون خطوات ELISA نادين خضراوي ، وهي فنية من مختبرنا.لبدء إجراء امتزاز المستضد ، اسحب 12 مستضدا بكتيريا غير متجانس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق واضبط تركيز البروتين المقابل لنصف المصل المضاد المراد امتصاصه. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لخليط المستضد عند 14،000 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لجمع الحبيبات. ثم, إعادة تعليق بيليه مع تنقية متعددة النسيلة المضادة للميكوبلازما الرئوية IgG واحتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع التحريض البطيء.في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للتعليق مرة أخرى عند 14،000 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية واستعادة المادة الطافية المقابلة لمصل الميكوبلازما الرئوية متعدد النسيلة. لطلاء صفيحة ELISA ذات 96 بئرا بجسم مضاد للالتقاط ، قم بتخفيف الجسم المضاد إلى 10 ميكروغرام لكل ملليلتر و 0.1 محلول بيكربونات كربونات المولي عند درجة الحموضة 9.6. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الطلاء وغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل. بعد ذلك ، قم بسد الأسطح غير المنضمة للآبار المطلية بإضافة 100 ميكرولتر من محلول الحجب إلى كل بئر. بعد احتضان اللوحة من ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محلول الحجب باستخدام ماصة واغسل اللوحة كما هو موضح سابقا.أضف كمية متساوية من البروتينات الكاملة الميكوبلازما الرئوية بتركيز 10 نانوجرام لكل بئر واترك تفاعل مولد الضد والجسم المضاد يحدث لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المستضد الزائد وغسل اللوحة كما هو موضح. بعد ذلك ، قم بتخفيف عينات اختبار المصل البشري والإشارة إلى ضوابط المصل الإيجابية والسلبية.بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من عينات الاختبار المخففة والضوابط في الآبار والتكرارات المناسبة. ضع علامة على الآبار التي لا تحتوي على مستضد أو أمصال فارغة. بعد احتضان اللوحة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة محلول المصل وغسل اللوحة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل.ماصة 100 ميكرولتر من الإنزيم المخفف المناسب المترافق الكشف عن الأجسام المضادة لكل بئر واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في الظلام. بعد إزالة أجسام الكشف غير المنضمة وغسل اللوحة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول TMB Chromogen لتصور ارتباط الجسم المضاد بالمستضد. دع اللوحة تتطور لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.ثم أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من حمض الكبريتيك بنسبة 7.5٪. أخيرا ، اقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة وقم بفرز النتائج بناء على حساب مؤشر الإيجابية. كشف تحليل اللطخة المناعية بين الميكوبلازما الرئوية غير الممتصة متعددة النسيلة والمستضدات البكتيرية غير المتجانسة عن تفاعل متقاطع ولكن بكثافة متفاوتة.على سبيل المثال ، أظهر مستضدات الميكوبلازما غاليسبتيكوم ومستضدات الميكوبلازما إيميتان أقوى تفاعل على الرغم من كونها ميكوبلازما الطيور. في المقابل ، لم تظهر أي من العزلتين السريريتين البشريتين ل Ureaplasma urealyticum أي تفاعل. ومع ذلك ، أسفرت مستضدات أنواع الميكوبلازما التناسلية البشرية المتبقية والمستضدات البكتيرية الأخرى عن تفاعلات متقاطعة كبيرة مع المصل المضاد.أكد تحليل اللطخة المناعية كفاءة امتزاز المصل متعدد النسيلة الميكوبلازما الرئوية ضد المستضدات البكتيرية غير المتجانسة. ألغى إجراء الامتزاز جميع التفاعلات المتقاطعة ، مما جعل المصل المضاد للميكوبلازما الرئوية محددا لجميع الاختبارات المصلية والمناعية اللاحقة. علاوة على ذلك ، أثبتت مجموعة الأمصال البشرية التي تم اختبارها باستخدام التقاط المستضد ELISA التي تم تطويرها في هذه الدراسة أنها إيجابية للميكوبلازما الرئوية IgG مع خصوصية جيدة.يتم تأمين خصوصية ELISA بشكل أساسي من خلال تقنية الامتزاز ، حيث أنه من الأساسي إجراء هذه الخطوة الحاسمة بعناية وتكرارها مرتين أو ثلاث مرات على الأقل. يمكن تطبيق مبدأ هذه التقنية لتشخيص أنواع الميكوبلازما الأخرى أو البكتيريا الأخرى بشكل عام. ومع ذلك ، يجب أن يكون اختيار المستضدات البكتيرية للامتزاز غير ذي صلة وكاف.

antigen-capture-enzyme-linked-immunosorbent-assay-for-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

اكتشاف بروتين Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME (انزيم مرتبط المناعي المغناطيسي الكهروكيميائية) طرق الكشف عن السموم الفطرية

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

الأليل محددة التعبير الجيني الفحص لفحص الأسس الفنية للجمعيات الوراثية

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

PCR الأمثل القائم على الكشف عن المفطورة

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within the brain, ascorbate acts in a neuroprotective and neuromodulatory manner that involves ascorbate cycling between neurons and vicinal astrocytes - a relationship that appears to be crucial for brain ascorbate homeostasis. Additionally, emerging evidence strongly suggests that ascorbate has a greatly expanded role in regulating cellular and systemic iron metabolism than is classically recognized. The increasing recognition of the integral role of ascorbate in normal and deregulated cellular and organismal physiology demands a range of medium-throughput and high-sensitivity analytic techniques that can be executed without the need for highly expensive specialist equipment. Here we provide explicit instructions for a medium-throughput, specific and relatively inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Ascorbate plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. Here we describe a medium-throughput, specific and inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

A السريع والنوعي صفيحة ميكروسكوبية الفحص لتحديد أسكوربات البينية وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

مقايسة متعدد الكشف عن الملاريا بث البعوض

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

الكشف عن التعبير الجيني بين الخلايا في الخلايا الحية من الفئران، الإنسان ولحم الخنزير المنشأ عن طريق النانوية المسمى الإسفار

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

متوازي عالية الإنتاجية واحد جزيء واحد اختبار حركي لشق الحمض النووي الموقع محددة

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.