Name: antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for specific detection of mycoplasma pneumoniae
Uploaded: 2023-02-24T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae at JoVE.com

Это исследование финансировалось Министерством здравоохранения Туниса и Министерством высшего образования и научных исследований Туниса.

Настоящее исследование было проведено в соответствии с этическими аспектами, установленными этическим комитетом Института Пастера в Тунисе.
1. Этапы подготовки к ИФА: предварительные требования и предварительная обработка
<ol><li>Бактериальные штаммы и питател?...

<ol>
	<li>Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+and+pathogenicity+of+mycoplasmas.">Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).</li><li>Chanock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+infections+of+man.">Mycoplasma infections of man.</a> The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).</li><li>Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+pneumoniae:+Usual+suspect+and+unsecured+diagnosis+in+the+acute+setting.">Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting.</a> The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).</li><li>Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+cytadhesion+of+Mycoplasma+pneumoniae.">Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae.</a> Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).</li><li>Waldo, R. H., Krause, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+stability,+and+function+of+cytadhesin+P1+and+accessory+protein+B/C+complex+of+Mycoplasma+pneumoniae.">Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae.</a> Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).</li><li>Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+pathogenesis+and+detection+of+Mycoplasma+pneumoniae+infections.">New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections.</a> Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).</li><li>Narita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+extrapulmonary+manifestations+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection+with+special+reference+to+pneumonia.">Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).</li><li>Kashyap, S., Sarkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+pneumonia:+Clinical+features+and+management.">Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management.</a> Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).</li><li>Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+versus+serology+for+diagnosing+Mycoplasma+pneumoniae+infection:+A+systematic+review+&amp;+meta-analysis.">PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review &amp; meta-analysis.</a> Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).</li><li>Saraya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+pneumoniae+infection:+Basics.">Mycoplasma pneumoniae infection: Basics.</a> Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).</li><li>Jacobs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infections:+a+critical+review+of+current+procedures.">Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures.</a> Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).</li><li>Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection:+3.+Detection+of+IgM+antibodies+to+M.+pneumoniae+by+a+modified+indirect+haemagglutination+test.">Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test.</a> Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).</li><li>Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+pneumoniae+infections:+diagnosis+based+on+immunofluorescence+titer+of+IgG+and+IgM+antibodies.">Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).</li><li>Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+detection+of+Mycoplasma+pneumoniae+antibodies.">Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).</li><li>Van Griethuysen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+the+early+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection.">Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection.</a> European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).</li><li>Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+diagnosis+of+Mycoplasma+pneumoniae+infection+by+enzyme+immunoassay.">Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay.</a> Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).</li><li>Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+cross-reactive+antibodies+to+mycoplasmas+in+human+sera+by+ELISA+and+immunoblotting.">Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting.</a> Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).</li><li>Brunner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpectedly+high+frequency+of+antibody+to+Mycoplasma+pneumoniae+in+human+sera+as+measured+by+sensitive+techniques.">Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques.</a> Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).</li><li>Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+analysis+of+Mycoplasma+pneumoniae:+3.+Separation+and+chemical+identification+of+serological+active+lipids.">Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids.</a> Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).</li><li>Ponka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+and+clinical+picture+of+serologically+verified+Mycoplasma+pneumoniae+infections+with+emphasis+on+central+nervous+system,+cardiac+and+joint+manifestations.">The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations.</a> Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets.+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications.</a> Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+detection+of+avian+mycoplasmas+in+culture.">An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture.</a> Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).</li><li>Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adsorption+procedure+to+increase+the+specificity+of+enzyme-linked+immunosorbent+assays+for+lyme+disease+without+decreasing+sensitivity.">An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity.</a> Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).</li><li>Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+and+treatment+of+mycoplasmal+infections.">The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections.</a> Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).</li><li>Meyer, R. D., Clough, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extragenital+Mycoplasma+hominis+infections+in+adults:+emphasis+on+immunosuppression.">Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression.</a> Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).</li><li>Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+host+specificity:+Fact+or+fiction.">Mycoplasma host specificity: Fact or fiction.</a> Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).</li><li>Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+lipofaciens+transmission+to+veterinarian.">Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).</li><li>Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mycoplasma+species+from+a+patient+with+seal+finger.">Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger.</a> Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).</li><li>Slack, M., P, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+role+of+Haemophilus+influenzae+in+community-acquired+pneumonia.">A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia.</a> Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).</li><li>Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+Streptococcus+pyogenes:+public+health+risk+factors,+prevention+and+control.">A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control.</a> Pathogens. 10 (2), 248 (2021).</li><li>Steinitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+the+blocking+effect+of+Tween+20+and+bovine+serum+albumin+in+ELISA+microwells.">Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells.</a> Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).</li><li>Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+mycoplasmas:+cultivation+and+vertebrate+pathogenicity+of+a+new+spiroplasma.">Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma.</a> Science. 195 (4281), 892-894 (1977).</li><li>Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+medium+for+the+isolation+of+avian+mycoplasmas.">A medium for the isolation of avian mycoplasmas.</a> American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli.">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li></ol>

В настоящем документе представлено общее описание собственной ИФА, в основном разработанной для обеспечения специфического скрининга M. pneumoniae инфекция. Приведены подробности о протоколе самого анализа ИФА, а также о некоторых этапах предварительной и постобработки. Специфика эт?...

Микоплазмы являются одними из самых маленьких и простых известных прокариот. Они в основном отличаются от других бактерий отсутствием структуры клеточной стенки. Таким образом, микоплазмы были классифицированы в отдельный класс под названием Mollicutes1. Дефицит клеточной стенки придает внутреннюю устойчивость этим микроорганизмам против некоторых антимикробных агентов и в значительной степени отвечает за их полиморфизм. Микоплазмы имеют малый геном и уменьшенные размеры, что ограничивает их метаболические и биосинтетические возможности и объясняет их паразитарную и сапрофитную природу1.
Mycoplasma pneumoniae является одной из микоплазм, которые заражают человека, и считается самой вирулентной2. M. pneumoniae колонизирует верхние дыхательные пути, что приводит к атипичной пневмонии у детей и молодых людей. Клинические признаки, порожденные инфекцией M. pneumoniae, похожи на грипп, с головной болью, лихорадкой и кашлем3. Цитадренция M. pneumoniae к клеткам-хозяева опосредована органеллой прикрепления, включающей большую адгезию P1 и несколько вспомогательных белков 4,5. Более клинические проявления могут возникать из-за местного воспаления и стимуляции иммунной системы хозяина в результате тесного присоединения M. pneumoniae к слизистой оболочке дыхательных путей6. Хотя пневмония является отличительной чертой инфекции M. pneumoniae, было выявлено, что инфекция этой бактерией также может быть ответственна за широкий спектр нелегочных проявлений в различных анатомических местах, таких как центральная нервная система, сердце, кожа и суставы7.
Как и для всех видов Mycoplasma, диагностика M. pneumoniae является сложной. Клинические признаки, вызывающие микоплазмоз, в основном неочевидные и нехарактерные8. Поскольку очень трудно диагностировать инфекцию M. pneumoniae, полагаясь только на клинические проявления и симптомы, лабораторный скрининг представляет особый интерес9. Обнаружение колоний M. pneumoniae по культуре является золотым стандартом для правильной диагностики. Однако привередливые требования к росту и длительное время, необходимое для доставки окончательных результатов (1-2 недели), усложняют культуру и, таким образом, означают, что она редко используется для рутинной диагностики10. Технологии амплификации нуклеиновых кислот были проверены с точки зрения скорости и эффективности, хотя из-за их относительно высокой стоимости и недоступности в некоторых медицинских учреждениях эти молекулярные методы не считаются диагностическими тестами первой линии. Это правда, что коммерческие ПЦР-тесты широко используются для диагностики инфекций M. pneumoniae, но они все еще не могут заменить серологию. Кроме того, частое появление как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов ограничило использование ПЦР9. Как правило, серология остается наиболее практикуемой в лабораториях для диагностики инфекции M. pneumoniae. В течение десятилетий сообщалось о нескольких серологических подходах, таких как холодные гемагглютинины, тест фиксации комплемента11, тест на непрямую гемагглютинацию12, иммунофлуоресценция13 и технология ИФА, которая была впервые применена к серологии микоплазмы в начале 1980-х годов 14,15,16. Одной из основных проблем, возникающих при выполнении ИФА-серодиагностики инфекции M. pneumoniae, являются перекрестные реакции, что значительно снижает специфичность методики. Ранее сообщалось о неспецифической адсорбции сывороток человека антигенами M. pneumoniae; на самом деле, многие из антител, обнаруженных с помощью ИФА в сыворотках человека, не всегда могут быть связаны с микоплазмальными антигенами17 из-за общности M. pneumoniae с некоторыми бактериями18,19 и некоторыми тканями животных и человека20.
Из-за высоких фоновых показаний, наблюдаемых в обычном тесте ИФА, который практиковался в лаборатории, интерпретация результатов часто была сложной, и, таким образом, постановка правильного диагноза M. pneumoniae была трудным заданием. Столкнувшись с этой проблемой, мы решили улучшить ИФА M. pneumoniae , удалив неспецифические реакции антигенов M. pneumoniae с антителами, подлежащими тестированию. С этой целью мы работали над селективным истощением неспецифических антигенов M. pneumoniae с использованием метода адсорбции. Фактически, основной целью ИФА захвата антигена является конкретное обнаружение иммуноглобулина M. pneumoniae (Ig) G в образцах сыворотки крови человека. Концепция этого ИФА состоит в основном из селективного захвата специфических антигенов M. pneumoniae, перед добавлением образцов сыворотки крови человека. Эта селективность обеспечивается инкубацией сырого антигена M. pneumoniae с поликлональной антисывороткой M. pneumoniae , продуцируемой у кроликов в лаборатории, и превращением ее в видоспецифичным путем адсорбции против группы гетерологичных бактерий, принадлежащих или не принадлежащих к классу Mollicutes, разделяющих антигены с M. pneumoniae виды и/или известные колонизирующие дыхательные пути. Процедуру адсорбции повторяли трижды, а ее эффективность по устранению перекрестной реактивности проверяли иммуноблоттингом. Разработанный ИФА-анализ представляет собой комбинацию сэндвича и непрямого ИФА. Вкратце, колодцы ИФА-пластины сначала покрываются поликлональной антисывороткой, специфичной для M. pneumoniae. Затем добавляется антиген M. pneumoniae и захватывается между антисывороткой и антителами, присутствующими в образце сыворотки для тестирования. Сформированный иммунологический комплекс обнаруживается вторичным фермент-конъюгированным антителом (пероксидазо-конъюгированный IgG). Реакции визуализируются добавлением хромогенного субстрата, а поглощение измеряется спектрофотометрически. Этот внутренний ИФА схематично представлен на рисунке 1. Домашний ИФА оказался эффективным в выявлении инфекции M. pneumoniae и в настоящее время является одним из наиболее практикуемых тестов в рутинной диагностической деятельности.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-chloro-1-naphtol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6788-50 TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50 Cap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL1066&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0058-N1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco PPLO Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>255420</td>
			<td>Frey media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate-Reader</td>
			<td>MULTISKAN GO, Thermo Scientific</td>
			<td>Ref: 51119200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>FBS-12A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>656120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid 37%</td>
			<td>Prolab</td>
			<td>2025.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>HI01361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Prepared in Pasteur Institute of Tunis</td>
			<td></td>
			<td>Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit</td>
			<td>Produced in Pasteur Institute of Tunis</td>
			<td></td>
			<td>Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7004-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium (1 MIU)</td>
			<td>PANPHARMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>fluka chemika</td>
			<td>77660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>902887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Novachim</td>
			<td>PS02805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1007311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal</td>
			<td>USB</td>
			<td>22215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB substrate (3,3&#8217;, 5,5&#8217; TetraMethyl-Benzidine solution)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6791-1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1379-500 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract, powder, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J23547&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for specific detection of mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae - это прокариот с дефицитом клеточной стенки, который, как известно, в основном колонизирует дыхательные пути человека и является эндемичным, с эпидемическим пиком каждые 6 лет, у детей старшего возраста и молодых людей. Диагностика M. pneumoniae является сложной задачей из-за привередливой природы возбудителя и возможности бессимптомного носительства. Лабораторная диагностика инфекции M. pneumoniae на основе титрования антител в образцах сыворотки пациентов остается наиболее практикуемым методом. Из-за потенциальной проблемы иммунологической перекрестной реактивности с использованием поликлональной сыворотки для M. pneumoniae был разработан иммуносорбентный анализ антиген-захвата (ИФА) для улучшения специфичности серологической диагностики. Пластины ИФА покрыты поликлональными антителами M. pneumoniae , выращенными у кроликов и специфичными после адсорбции против панели гетерологичных бактерий, которые разделяют антигены с видами M. pneumoniae и/ или, как известно, колонизируют дыхательные пути. Реагирующие гомологичные антигены M. pneumoniae затем специфически распознаются по соответствующим антителам в образцах сыворотки. Дальнейшая оптимизация физико-химических параметров, которым подвергается ИФА захвата антигена, привела к получению высокоспецифичного, чувствительного и воспроизводимого ИФА.

Иммуноблоттинговая активность неадсорбированной поликлональной Mycoplasma pneumoniae против оболочки к гетерологичным бактериям Перекрестная реактивность действительно существует, как показано в результатах иммуноблоттинга (рисунок 2), и по ...

Watch this Scientific Journal Video about Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae at JoVE.com

Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae

При инфекции Mycoplasma pneumoniae серологические тесты могут давать хорошие результаты, но с низкой специфичностью из-за иммунологической перекрестной реакции. Собственный ИФА захвата антигена, описанный в этой статье, гарантирует высокую видовую специфичность и, как было показано, является надежным скрининговым тестом для точной диагностики M. pneumoniae.

Антиген-захват фермент-связанный иммуносорбентный анализ для специфического обнаружения Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae is a cell wall-deficient prokaryote, mainly known to colonize the human respiratory tract and to be endemic, with epidemic peaks ...

Что касается всех пациентов с микоплазмой, их диагноз Mycoplasm pneumoniae является сложным из-за перекрестных реакций. Предлагаемый нами ИФА основан на селективном истощении неспецифических антигенов Mycoplasm pneumoniae с использованием метода адсорбции. Собственный ИФА захвата антигена, описанный в этом видео, гарантирует высокую специфичность пространства.И на самом деле, он зарекомендовал себя как надежный скрининговый тест для точной диагностики инфекции Mycoplasm pneumoniae. Демонстрировать шаги перед ИФА будет Имен Чниба, аспирант. А на ступенях ИФА будет Надин Хадрауи, техник из нашей лаборатории.Чтобы начать процедуру адсорбции антигенов, вытащите 12 гетерологичных бактериальных антигенов в микроцентрифужную трубку и отрегулируйте концентрацию белка, соответствующую половине антисыворотки, подлежащей адсорбированию. Затем центрифугируйте смесь антигенов при 14 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы собрать гранулу. Затем повторно суспендировать гранулу с очищенным поликлональным антимикоплазмой пневмонией IgG и инкубировать в течение двух часов при 37 градусах Цельсия с медленным перемешиванием.В конце инкубации центрифугируют суспензию снова при 14 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и восстанавливают супернатант, соответствующий специфическому поликлональному антисывороту Mycoplasma pneumoniae. Чтобы покрыть 96-луночную ИФА-пластину захватным антителом, разводят антитело до 10 мкг на миллилитр и 0,1 молярного карбонатного бикарбонатного буфера при рН 9,6. Затем добавляют 100 микролитров разбавленного антитела к каждой лунке микропластины и инкубируют в течение ночи при четырех градусах Цельсия.На следующий день снимите раствор покрытия и вымойте пластину пять раз моющим буфером. Далее блокируют несвязанные поверхности покрытых скважин, добавляя в каждую скважину по 100 микролитров блокирующего раствора. После инкубации пластины от одного часа при комнатной температуре удалите блокирующий раствор пипеткой и промойте пластину, как было показано ранее.Добавьте равное количество цельных белков Mycoplasma pneumoniae в концентрации 10 нанограмм на лунку и дайте реакции антиген-антитело протекать в течение двух часов при комнатной температуре. После инкубации удалите избыток антигена и вымойте пластину, как показано. Затем разбавьте образцы сыворотки крови человека и ссылайтесь на положительный и отрицательный контроль сыворотки.Затем добавьте 100 микролитров разбавленных проб и контрольных образцов в соответствующие скважины и дубликаты. Пометьте лунки, не содержащие ни антигена, ни сыворотки, как пустые. После инкубации тарелки в течение 90 минут при комнатной температуре удалите раствор сыворотки и промойте пластину пять раз с помощью промывочного буфера.Пипетка 100 микролитров соответствующего разбавленного фермента конъюгированных детектирующих антител к каждой лунке и инкубируют в течение одного часа при 37 градусах Цельсия в темноте. После удаления несвязанных органов обнаружения и промывки пластины добавляют 100 микролитров раствора хромогена TMB для визуализации связывания антигена с антителом. Дайте пластине развиться в течение 30 минут при комнатной температуре.Затем остановите реакцию, добавив 100 микролитров 7,5% серной кислоты. Наконец, считайте поглощение на 450 нанометров с помощью микропластичного считывателя и отсортируйте результаты на основе расчета индекса позитивности. Иммуноблотический анализ между Mycoplasma pneumoniae неассорбированной поликлональной антисывороткой и гетерологичными бактериальными антигенами выявил перекрестную реактивность, но с различной интенсивностью.Например, антигены Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma imitans показали самую сильную реактивность, несмотря на то, что они были птичьими микоплазмами. Напротив, ни один из двух человеческих клинических изолятов Ureaplasma urealyticum не показал никакой реакции. Однако антигены остальных видов генитальных микоплазм человека и другие бактериальные антигены давали значительные перекрестные реакции с антисывороткой.Иммуноблотический анализ подтвердил эффективность поликлональной антисыворотной адсорбции Mycoplasma pneumoniae против гетерологичных бактериальных антигенов. Процедура адсорбции устранила все перекрестные реакции, тем самым сделав Mycoplasma pneumoniae antiserum специфичным для всех последующих серологических и иммуноблоттинговых тестов. Кроме того, набор человеческих сывороток, протестированных с использованием ИФА захвата антигена, разработанный в этом исследовании, оказался положительным для Mycoplasma pneumoniae IgG с хорошей специфичностью.Специфика этого ИФА в основном страхуется методом адсорбции, так как изначально необходимо тщательно выполнять этот критический шаг и повторять его не менее двух или трех раз. Принцип этой методики может быть применен для диагностики других видов микоплазм или других бактерий в целом. Однако отбор бактериальных антигенов для адсорбции должен быть неактуальным и адекватным.

antigen-capture-enzyme-linked-immunosorbent-assay-for-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Обнаружение белка убиквитинирования

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME (фермент иммуноферментный магнитных электрохимический) метод обнаружения микотоксинов

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Аллель-специфичная Анализ экспрессии генов для тестирования функциональной основе генетических ассоциаций

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Хроматин Иммунопреципитация Пробирной для тканеспецифические Гены использованием ранней стадии эмбрионы мыши

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Оптимизированная на основе ПЦР Выявление Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within the brain, ascorbate acts in a neuroprotective and neuromodulatory manner that involves ascorbate cycling between neurons and vicinal astrocytes - a relationship that appears to be crucial for brain ascorbate homeostasis. Additionally, emerging evidence strongly suggests that ascorbate has a greatly expanded role in regulating cellular and systemic iron metabolism than is classically recognized. The increasing recognition of the integral role of ascorbate in normal and deregulated cellular and organismal physiology demands a range of medium-throughput and high-sensitivity analytic techniques that can be executed without the need for highly expensive specialist equipment. Here we provide explicit instructions for a medium-throughput, specific and relatively inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Ascorbate plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. Here we describe a medium-throughput, specific and inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Быстрое и Удельный Микропланшетный Анализ для определения внутри-и внеклеточной аскорбат в культивируемых клетках

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Анализ Multi-обнаружения малярии комарами

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Обнаружение внутриклеточных экспрессии генов в живых клетках мышиных, человеческого и свиного происхождения с помощью флуоресцентной меченных наночастиц

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Параллельная высокая пропускная способность одной молекулы кинетический анализ для сайта-специфического расщепления ДНК

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.