Name: antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for specific detection of mycoplasma pneumoniae
Uploaded: 2023-02-24T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae at JoVE.com

Este estudio fue financiado por el Ministerio de Salud de Túnez y el Ministerio de Educación Superior e Investigación Científica de Túnez.

El presente estudio se ha realizado de conformidad con los aspectos éticos establecidos por el comité de ética del Instituto Pasteur de Túnez.
1. Pasos previos a ELISA: requisitos previos y preprocesamiento
<ol><li>Cepas bacterianas y medios de crecimiento NOTA: Las especies de Mollicutes y las bacterias amuralladas utilizadas en el presente estudio y sus medios de crecimiento se enumeran en la Tabla 1.<ol><li>Crecimiento de especies de Mollicutes<ol>...

<ol>
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Este documento presenta una descripción general de un ELISA interno desarrollado principalmente para garantizar la detección específica de M. pneumoniae Infección. Se proporcionan los detalles sobre el protocolo del ensayo ELISA en sí, así como algunos pasos previos y posteriores al procesamiento. La especificidad de este ensayo está garantizada por la técnica de adsorción. Este procedimiento fue descrito previamente en pruebas ELISA desarrolladas para el diagnóstico de humanos y aves Mycoplasmas</...

Los micoplasmas se encuentran entre los procariotas más pequeños y simples conocidos. Se distinguen principalmente de otras bacterias por la falta de una estructura de pared celular. Por lo tanto, los micoplasmas se clasificaron en una clase separada llamada Mollicutes1. La deficiencia de la pared celular confiere resistencia intrínseca a estos microorganismos contra algunos agentes antimicrobianos y es en gran parte responsable de su polimorfismo. Los micoplasmas tienen un genoma pequeño y un tamaño reducido, lo que limita sus capacidades metabólicas y biosintéticas y explica su naturaleza parasitaria y saprofita1.
Mycoplasma pneumoniae es uno de los Mycoplasmas que infectan al hombre y se cree que es el más virulento2. M. pneumoniae coloniza el tracto respiratorio superior, lo que lleva a neumonía atípica en niños y adultos jóvenes. Los signos clínicos engendrados por la infección por M. pneumoniae son similares a la gripe, con dolor de cabeza, fiebre y tos3. La citadherencia de M. pneumoniae a las células huésped está mediada por un orgánulo de unión que incluye la adhesión mayor P1 y varias proteínas accesorias 4,5. Pueden ocurrir más manifestaciones clínicas debido a la inflamación local y la estimulación del sistema inmune del huésped resultante de la adhesión íntima de M. pneumoniae a la mucosa de la vía aérea6. A pesar de que la neumonía es un sello distintivo de la infección por M. pneumoniae, se ha revelado que la infección con esta bacteria también puede ser responsable de un amplio espectro de manifestaciones no pulmonares en diferentes sitios anatómicos como el sistema nervioso central, corazón, piel y articulaciones7.
Como para todas las especies de Mycoplasma, el diagnóstico de M. pneumoniae es un desafío. Los signos clínicos que evocan micoplasmosis son en su mayoría inaparentes y no característicos8. Dado que es muy difícil diagnosticar la infección por M. pneumoniae basándose únicamente en las manifestaciones clínicas y los síntomas, el cribado de laboratorio es de particular interés9. La detección de colonias de M. pneumoniae por cultivo es el método estándar de oro para un diagnóstico adecuado. Sin embargo, los exigentes requerimientos de crecimiento y el largo tiempo necesario para la entrega de resultados definitivos (1-2 semanas) complican el cultivo, y por lo tanto significa que rara vez se utiliza para el diagnóstico de rutina10. Las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos se validaron en términos de velocidad y eficiencia, aunque debido a su costo relativamente alto y la falta de disponibilidad en algunos centros de salud, estas técnicas moleculares no se consideran pruebas diagnósticas de primera línea. Es cierto que las pruebas PCR comerciales se utilizan ampliamente para diagnosticar infecciones por M. pneumoniae, pero aún no pueden reemplazar la serología. Además, la frecuente aparición de resultados falsos negativos y falsos positivos ha limitado el uso de la PCR9. Rutinariamente, la serología sigue siendo la más practicada en los laboratorios para el diagnóstico de la infección por M. pneumoniae. Se han reportado varios enfoques serológicos durante décadas, como las hemaglutininas frías, la prueba de fijación del complemento 11, la prueba de hemaglutinación indirecta12, la inmunofluorescencia 13 y la tecnología de ELISA, que se aplicó por primera vez a la serología de micoplasmas a principios de la década de 198014,15,16. Uno de los principales problemas encontrados al realizar el serodiagnóstico ELISA de la infección por M. pneumoniae son las reacciones cruzadas, lo que reduce considerablemente la especificidad de la técnica. Se informó previamente de adsorción inespecífica de sueros humanos con antígenos de M. pneumoniae; de hecho, muchos de los anticuerpos detectados por ELISA en sueros humanos no siempre pueden estar unidos a antígenos micoplasmáticos 17, debido a la similitud de M. pneumoniae con algunas bacterias18,19 y algunos tejidos animales y humanos20.
Debido a las altas lecturas de fondo observadas en la prueba ELISA convencional que se practicó en el laboratorio, la interpretación de los resultados a menudo era complicada y, por lo tanto, la entrega de un diagnóstico adecuado de M. pneumoniae era una tarea difícil. Mientras enfrentábamos este problema, optamos por mejorar el ELISA de M. pneumoniae eliminando reacciones inespecíficas de antígenos de M. pneumoniae con anticuerpos para ser probados. Para ello, se trabajó en el agotamiento selectivo de los antígenos inespecíficos de M. pneumoniae mediante la técnica de adsorción. De hecho, el objetivo principal del ELISA de captura de antígeno es detectar específicamente la inmunoglobulina (Ig) G de M. pneumoniae en muestras de suero humano. El concepto de este ELISA consiste principalmente en la captura selectiva de antígenos específicos de M. pneumoniae, antes de añadir las muestras de suero humano. Esta selectividad se asegura incubando el antígeno crudo de M. pneumoniae con un antisuero policlonal de M. pneumoniae, producido en conejos en el laboratorio y haciéndolo específico de la especie por adsorción contra un panel de bacterias heterólogas, pertenecientes o no a la clase Mollicutes, que comparten antígenos con M . pneumoniae especies y/o conocidas por colonizar las vías respiratorias. El procedimiento de adsorción se repitió tres veces, y su eficacia para eliminar la reactividad cruzada se probó mediante inmunotransferencia. El ensayo ELISA desarrollado es una combinación de ELISA sándwich e indirecto. Brevemente, los pocillos de la placa ELISA se recubren primero con un antisuero policlonal específico para M. pneumoniae. Luego, se agrega el antígeno de M. pneumoniae y queda atrapado entre el antisuero y los anticuerpos presentes en la muestra de suero que se va a analizar. El complejo inmunológico formado es detectado por un anticuerpo secundario conjugado con enzimas (IgG conjugada con peroxidasa). Las reacciones se visualizan mediante la adición de sustrato cromogénico, y la absorbancia se mide espectrofotométricamente. Este ELISA interno se presenta esquemáticamente en la Figura 1. El ELISA casero demostró ser eficiente en la detección específica de la infección por M. pneumoniae y actualmente es una de las pruebas más practicadas en la actividad diagnóstica de rutina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-chloro-1-naphtol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6788-50 TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonate bicarbonate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3041-50 Cap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL1066&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0058-N1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco PPLO Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>255420</td>
			<td>Frey media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate-Reader</td>
			<td>MULTISKAN GO, Thermo Scientific</td>
			<td>Ref: 51119200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Capricorn Scientific</td>
			<td>FBS-12A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>656120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid 37%</td>
			<td>Prolab</td>
			<td>2025.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>HI01361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Prepared in Pasteur Institute of Tunis</td>
			<td></td>
			<td>Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit</td>
			<td>Produced in Pasteur Institute of Tunis</td>
			<td></td>
			<td>Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7004-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium (1 MIU)</td>
			<td>PANPHARMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>fluka chemika</td>
			<td>77660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>902887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Novachim</td>
			<td>PS02805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1007311011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimerosal</td>
			<td>USB</td>
			<td>22215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB substrate (3,3&#8217;, 5,5&#8217; TetraMethyl-Benzidine solution)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab142042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6791-1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1379-500 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract, powder, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>J23547&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay for specific detection of mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae es un procariota deficiente en la pared celular, conocido principalmente por colonizar el tracto respiratorio humano y ser endémico, con picos epidémicos cada 6 años, en niños mayores y adultos jóvenes. El diagnóstico de M. pneumoniae es difícil debido a la naturaleza fastidiosa del patógeno y la posibilidad de transporte asintomático. El diagnóstico de laboratorio de la infección por M. pneumoniae basado en la titulación de anticuerpos en las muestras de suero de los pacientes sigue siendo el método más practicado. Debido al problema potencial de la reactividad cruzada inmunológica con el uso de suero policlonal para M. pneumoniae, se ha desarrollado un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de antígeno (ELISA) para mejorar la especificidad del diagnóstico serológico. Las placas ELISA están recubiertas con anticuerpos policlonales de M. pneumoniae, criados en conejos y específicos después de la adsorción contra un panel de bacterias heterólogas que comparten antígenos con especies de M. pneumoniae y / o se sabe que colonizan el tracto respiratorio . Los antígenos homólogos de M. pneumoniae reaccionados se reconocen específicamente por sus anticuerpos correspondientes en las muestras de suero. Una mayor optimización de los parámetros fisicoquímicos a los que se somete el ELISA de captura de antígeno condujo a un ELISA altamente específico, sensible y reproducible.

La actividad inmunoblotting del antisuero policlonal Mycoplasma pneumoniae no adsorbido a bacterias heterólogas La reactividad cruzada existe, como se muestra en los resultados de inmunotransferencia (Figura 2) y, en comparación con el control positivo (Carril 1), algunos de los antígenos de M. pneumoniae se comparten con las bacterias examinadas. La intensidad de estas reacciones cruzadas fue variable. Por ejemplo, ...

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Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae

En la infección por Mycoplasma pneumoniae, las pruebas serológicas pueden generar buenos resultados, pero con baja especificidad debido a la reacción inmunológica cruzada. El ELISA interno de captura de antígeno, descrito en este documento, garantiza una alta especificidad de la especie y ha demostrado ser una prueba de detección confiable para el diagnóstico preciso de M. pneumoniae.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de antígeno para la detección específica de Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae is a cell wall-deficient prokaryote, mainly known to colonize the human respiratory tract and to be endemic, with epidemic peaks ...

Como para todos los pacientes con micoplasma, su diagnóstico de Mycoplasm pneumoniae es difícil debido a las reacciones cruzadas. Nuestro ELISA propuesto se basa en la depleción selectiva de antígenos inespecíficos de Mycoplasm pneumoniae utilizando una técnica de adsorción. El ELISA de captura de antígenos interno descrito en este video garantiza una alta especificidad de espacios.Y en realidad, ha demostrado ser una prueba de detección confiable para un diagnóstico preciso de la infección por Mycoplasma pneumoniae. Demostrando los pasos previos a ELISA estará Imen Chniba, un estudiante de doctorado. Y los pasos de ELISA serán Nadine Khadraoui, una técnica de nuestro laboratorio.Para comenzar el procedimiento de adsorción de antígenos, tire de los 12 antígenos bacterianos heterólogos en un tubo de microcentrífuga y ajuste la concentración de proteína correspondiente a la mitad del antisuero a adsorber. A continuación, centrifugar la mezcla de antígenos a 14, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para recoger el pellet. Luego, vuelva a suspender el pellet con el policlonal purificado anti-Mycoplasma pneumoniae IgG e incube durante dos horas a 37 grados centígrados con agitación lenta.Al final de la incubación, centrifugar la suspensión nuevamente a 14, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recuperar el sobrenadante correspondiente al antisuero policlonal específico Mycoplasma pneumoniae. Para recubrir una placa ELISA de 96 pocillos con un anticuerpo de captura, diluya el anticuerpo a 10 microgramos por mililitro y tampón de bicarbonato de carbonato molar de 0.1 a pH 9.6. Luego, agregue 100 microlitros del anticuerpo diluido a cada pocillo de la microplaca e incube durante la noche a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, retire la solución de recubrimiento y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado. A continuación, bloquee las superficies no unidas de los pozos recubiertos agregando 100 microlitros de la solución de bloqueo a cada pozo. Después de incubar la placa desde una hora a temperatura ambiente, retire la solución de bloqueo con una pipeta y lave la placa como se demostró anteriormente.Añadir una cantidad igual de proteínas enteras de Mycoplasma pneumoniae a una concentración de 10 nanogramos por pocillo y permitir que la reacción antígeno-anticuerpo tenga lugar durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el exceso de antígeno y lave la placa como se demuestra. A continuación, diluya las muestras de prueba de suero humano y haga referencia a los controles de suero positivos y negativos.Luego, agregue 100 microlitros de las muestras de prueba diluidas y los controles en los pocillos y duplicados apropiados. Marque los pocillos que no contienen antígeno ni sueros como en blanco. Después de incubar la placa durante 90 minutos a temperatura ambiente, retire la solución de suero y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado.Pipetear 100 microlitros de la enzima diluida adecuada conjugada anticuerpos de detección a cada pocillo e incubar durante una hora a 37 grados centígrados en la oscuridad. Después de retirar los cuerpos de detección no unidos y lavar la placa, agregue 100 microlitros de solución TMB Chromogen para visualizar la unión antígeno-anticuerpo. Deje que la placa se desarrolle durante 30 minutos a temperatura ambiente.Luego, detenga la reacción agregando 100 microlitros de ácido sulfúrico al 7.5%. Finalmente, lea la absorbancia a 450 nanómetros utilizando un lector de microplacas y ordene los resultados en función del cálculo del índice de positividad. El análisis de inmunoblot entre el antisuero policlonal no adsorbido Mycoplasma pneumoniae y los antígenos bacterianos heterólogos reveló reactividad cruzada pero con intensidad variable.Por ejemplo, los antígenos Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma imitans mostraron la mayor reactividad a pesar de ser micoplasmas aviares. Por el contrario, ninguno de los dos aislados clínicos humanos de Ureaplasma urealyticum mostró ninguna reacción. Sin embargo, los antígenos de las especies restantes de micoplasma genital humano y otros antígenos bacterianos produjeron reacciones cruzadas considerables con el antisuero.El análisis de inmunoblot confirmó la eficacia de la adsorción policlonal antisuero Mycoplasma pneumoniae contra los antígenos bacterianos heterólogos. El procedimiento de adsorción eliminó todas las reacciones cruzadas, lo que hizo que el antisuero Mycoplasma pneumoniae fuera específico para todas las pruebas serológicas e inmunotransferencia posteriores. Además, el conjunto de sueros humanos probados utilizando el ELISA de captura de antígeno desarrollado en este estudio resultó positivo para Mycoplasma pneumoniae IgG con buena especificidad.La especificidad de este ELISA está asegurada principalmente por la técnica de adsorción, ya que es primordial realizar este paso crítico con cuidado y repetirlo al menos dos o tres veces. El principio de esta técnica se puede aplicar para diagnosticar otras especies de micoplasma u otras bacterias en general. Sin embargo, la selección de antígenos bacterianos para la adsorción debe ser irrelevante y adecuada.

Research

JoVE Journal

Biology

Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae

Detection of Protein Ubiquitination

La detección de ubiquitinación de proteínas

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Investigación

Biología

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