Name: 3-d time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in the moss physcomitrium patens
Uploaded: 2023-02-10T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Soucy Patricia og Betty Nunn ved University of Louisville for hjælp med det konfokale mikroskop. Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation (1456884 til MPR) og af en National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 til MPR).

BEMÆRK: Se materialetabellen for listen over materialer og udstyr og tabel 1 for listen over løsninger, der skal anvendes i denne protokol.
1. Forberedelse af planter til glasbundsfade
<ol><li>Mosprotonemalt væv dyrkes i BCDAT agarmedium i en 13 cm petriskål under konstant hvidt lys (~50 μmol m-2 s-1) i 7 dage ved 25 °C i vækstkammeret.</li>
	<li>Calcofluorhviden filtreres og opbevares ved 4 °C indtil brug. Reag...

<ol>
	<li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+construction,+perception,+and+remodeling+of+plant+cell+walls.">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li><li>Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+integrity+maintenance+during+plant+development+and+interaction+with+the+environment.">Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment.</a> Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).</li><li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+function+of+ROP+GTPase+prenylation+important+for+multicellularity+in+the+moss+Physcomitrium+patens.">The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens.</a> Development. 149 (12), (2022).</li><li>Colin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+living+plant+cell:+From+probes+to+quantification.">Imaging the living plant cell: From probes to quantification.</a> The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).</li><li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+plants.">Live cell imaging of plants.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).</li><li>Goh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live-cell+imaging+approaches+to+study+lateral+root+formation+in+Arabidopsis+thaliana.">Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana.</a> Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).</li><li>Hamant, O., Das, P., Burian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+developing+shoot+meristems+using+a+confocal+laser+scanning+microscope.">Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).</li><li>Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+FM4-64,+a+tool+for+tracing+the+endocytic+pathways+in+Arabidopsis+root+cells.">Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).</li><li>Yagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+synthetic+fluorescent+probe+labeling+for+live-cell+imaging+in+plants.">Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).</li><li>Whitewoods, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLAVATA+was+a+genetic+novelty+for+the+morphological+innovation+of+3D+growth+in+land+plants.">CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants.</a> Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).</li><li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PSTAIRE-type+cyclin-dependent+kinase+controls+light+responses+in+land+plants.">A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants.</a> Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).</li></ol>

Time-lapse 3-D rekonstruktion, eller 4-D billeddannelse, er et kraftfuldt værktøj til at observere dynamikken i cellulær morfologi under udviklingsprocesser. I denne protokol kan dynamikken i 3D-cellulær morfologi observeres i mosen P. patens ved at blande calcofluorhviden i mediet. Ved hjælp af denne metode observerede vi, at overfladen af cellevægge i ggb-mutanter rives fra hinanden under udvikling3. Desuden er den reducerede fortykkelse af cellevægge korreleret med cell...

Plantecellevægge gennemgår dynamiske ændringer under celleudvidelse og udvikling 1,2,3. Opretholdelse af cellevægsintegritet er afgørende for plantecelleadhæsion under vækst og udvikling samt for reaktionen på miljøsignaler. Selvom visualisering af cellevægsdynamik i levende celler over en lang periode er afgørende for at forstå, hvordan celleadhæsion opretholdes under udvikling og tilpasning til miljøændringer, er de nuværende metoder til direkte observation af cellevægsdynamik stadig udfordrende.
Time-lapse billeddannelse af cellulære ændringer kan give informativ udviklingsdynamik af en organisme ved hjælp af et fluorescensmikroskop med høj opløsning 4,5,6,7. Mens time-lapse 3D-billeddannelse har et stort potentiale for at studere dynamiske ændringer af celleform under vækst og udvikling, kræver teknikken normalt transformation af et fluorescerende protein 4,5,6,7. Men for de fleste systemer er genetiske transformationer enten tidskrævende eller teknisk udfordrende. Som et alternativ har fluorescerende farvestoffer, der fastgøres til cellulære komponenter, længe været tilgængelige. De fluorescerende farvestoffer kan udsende fluorescerende lys efter bestråling med lys med en bestemt bølgelængde. Almindelige eksempler er Edu, DAPI, PI, FM4-64 og calcofluor hvid 8,9,10. En stor ulempe er imidlertid, at disse farvestoffer typisk kun kan bruges i fast væv eller til korte forsøg, delvis på grund af den skade, de forårsager på cellen 8,9,10.
Med protokollen præsenteret her er calcofluorsignaler stabile, når calcofluor hvid blandes i mediet under time-lapse-eksperimenter i mos P. patens. Ved hjælp af denne metode blev frigørelsen af celler i ggb-mutanter ved hjælp af 3-D time-lapse-billeddannelse observeret over en 3-dages periode3 (figur 1). Denne metode kan anvendes på mange andre systemer, der indeholder cellevægge, og som kan farves af calcofluor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-mm-thick red plastic light filter</td>
			<td>&#160;Mitsubishi</td>
			<td>&#160;no.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mm diameter glass base dish&#160;</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>3930-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>A6924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white&#160;</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td>Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>A1</td>
			<td>
			NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>TE200&#160;</td>
			<td>Equipped with a DS-U3 camera;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gellan gum&#160;</td>
			<td>Nacali Tesque</td>
			<td>12389-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Growth Chambers</td>
			<td>SANYO&#160;</td>
			<td>Sanyo MLR-350H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized syringe 0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in the moss physcomitrium patens

Time-lapse billeddannelse med fluorescensmikroskopi tillader observation af de dynamiske ændringer i vækst og udvikling på cellulære og subcellulære niveauer. Generelt kræver teknikken til observationer over en lang periode transformation af et fluorescerende protein; Men for de fleste systemer er genetisk transformation enten tidskrævende eller teknisk utilgængelig. Dette manuskript præsenterer en protokol for 3-D time-lapse billeddannelse af cellevægsdynamik over en 3-dages periode ved hjælp af calcofluorfarvestof (som pletter cellulose i plantecellevæggen), udviklet i mos Physcomitrium patens. Calcofluorfarvestofsignalet fra cellevæggen er stabilt og kan vare i 1 uge uden åbenlyst henfald. Ved hjælp af denne metode har det vist sig, at frigørelsen af celler i ggb-mutanter (hvor proteinet geranylgeranyltransferase-I beta-underenhed er slået ud) skyldes ureguleret celleudvidelse og cellevægintegritetsdefekter. Desuden ændres mønstrene for calcofluorfarvning over tid; Mindre intenst farvede områder korrelerer med de fremtidige celleudvidelses- / forgreningssteder i vildtypen. Denne metode kan anvendes på mange andre systemer, der indeholder cellevægge, og som kan farves af calcofluor.

Denne metode tillader observation af cellevægsdynamik under udvikling i vildtype- og ggb-mutanter (figur 1). Resultaterne viste, at områder med mindre fortykkelse af cellevæggen korrelerer med celleekspansions- / forgreningsstederne, hvilket giver mulighed for forudsigelse af ekspansions- / forgreningssteder i vildtypen (figur 1A). Overfladen af cellevæggene i ggb-mutanter blev revet fra hinanden under udviklingen på grund af ukontrolleret...

Watch this Scientific Journal Video about 3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens at JoVE.com

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Dette manuskript præsenterer en detaljeret protokol til at afbilde 3D-cellevægsdynamikken i levende mosvæv, hvilket muliggør visualisering af frigørelse af cellevægge i ggb-mutanter og fortykkelse af cellevægsmønstre i vildtypen under udvikling over en lang periode.

3-D Time-Lapse Imaging af cellevægsdynamik ved hjælp af Calcofluor i Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

Time-lapse billeddannelse med fluorescensmikroskopi tillader observation af de dynamiske ændringer i vækst og udvikling på cellulære og subcellulære niveauer. Denne enkle protokol til 3D time-lapse-billeddannelse kan direkte studere cellevægsdynamik over en lang periode. Denne protokol bruger calcofluorfarvestof til at markere dynamikken i cellevægtykkelse og kræver derfor ikke en transformation af et fluorescerende protein.Calcofluorsignalerne er stabile og kan vare i mere end en uge. Denne metode kan anvendes på mange andre systemer med enkle strukturer, der indeholder cellevægge og kan farves af calcofluor, såsom i blomstrende planter. I denne protokol er calcofluorsignalerne stabile, når dette farvestof blandes i mediet under hele processen med time-lapse-billeddannelse.Til at begynde med spredes det syv dage gamle mosvæv i et 1,5 ml mikrorør indeholdende 20 mikroliter steriliseret vand. Til vildtypen skal du bruge tang til at adskille protonemata. For ggb-mutanten adskilles protonemata ved hjælp af AP-1000-pipette.Tilsæt 10 mikroliter steriliseret calcofluor-hvid i mikrorøret og lad røret stå lodret i emhætten i to minutter til farvning. Umiddelbart efter farvning blandes planterne med 200 mikroliter afkølet BCDATG indeholdende BCDAT-medium ved pipettering fem gange med en P1000-pipette og overføres blandingen til en 27 millimeter glasbundskål. Sørg for, at de 200 mikroliter BCDATG med prøver fordeles jævnt på overfladen af 27 millimeter glasbundskålen for at producere et tyndt lag film, så prøverne er inden for den objektive arbejdsafstand under billeddannelse.Efter størkning i to minutter ved stuetemperatur skal du dække det tynde lag med tre ml afkølet BCDATG og lade det sætte sig i 10 minutter for at størkne igen. På bunden af skålen tegner ni linjer hver i parallelle og vinkelrette retninger og markerer rækkerne med tegn fra A til H, og kolonnerne med tal fra et til otte. Brug øverste, nederste, højre, midterste og venstre til at markere positionerne i hver firkant.For eksempel, hvis en plante er i en firkant i anden række, i sjette kolonne og er placeret i øverste venstre del af firkanten, så får denne plante navnet b6 øverst til venstre. Placer glasbundskålen under hvidt lys i en til to dage, før den udsættes for time-lapse-billeddannelse hver dag i op til tre dage. For at rekonstruere 3D-billederne skal du åbne ND2-filen og klikke på lydstyrke.Rekonstruer cellevæggen på dag nul, dag et, dag tre og dag fire. Når du har taget hvert billede, skal du sætte den glasbaserede skål tilbage i vækstkammeret. Dynamiske ændringer i tværvægge blev vist ved calcofluor-hvid farvning i vildtype og ggb-mutanter.For ggb-mutanter angiver hvide stiplede linjer under hvert billede den ødelagte overfladecellevæg i de ekspanderende celler, og orange linjer angiver cellerne under cellevægoverfladen i ggb. Forskellene i calcofluor-hvidt signal kan detekteres på cellernes overfladepositioner, og mindre tæt farvede områder indikerede celleudvidelse i ggb-mutanter eller nyligt forgrenede steder i vildtypen. For vildtype prækultur kræves planterne i svagt rødt lys fra ovenstående i fem dage for at fremkalde protonemata's fototropiske reaktioner, så planterne kan fastgøres til bunden af retter, og planterne kan fremstå inden for den objektive arbejdsafstand under billeddannelse, fordi calcofluor-hvid kan bruges sammen med andet farvestof såsom mikrosfære.Yderligere oplysninger om celleudvidelsen kan også undersøges. Dynamikken i plantecellevæggen er afgørende for effektiv vækst og udvikling samt for respons på miljøsignal. Denne protokol giver mulighed for direkte opdeling af ændringer i cellevægssignaler og integration.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Sporing Celler i GFP-transgene zebrafisk Brug af Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Migration hjælp Cell transplantationer og Time-lapse Imaging i zebrafisk embryoner

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse af zebrafisk Kidney Udvikling med Time-lapse Imaging Ved hjælp af en dissektionsmikroskop Udstyret til Optical Sektionsinddeling

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Produktion og administration af terapeutiske mesenchymstamceller / Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed i 3-D kulturer Under Xeno-frie betingelser

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metode til Time-Lapse Imaging af dyrkede Rat Mesenteriske Mikrovaskulære Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi Photon tid bortfalder Imaging til at visualisere udvikling i realtid: visualisering af overflytning neurale Crest celler i zebrafisk embryoner

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Encellede kvantificering af Protein nedbrydning satser for Time-Lapse Fluorescens mikroskopi i vedhængende cellekultur

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Billeddannelse af muskel-sene morfogenese i Drosophila pupper

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analyse af Actomyosin dynamik på lokale cellulære og vævs skalaer ved hjælp af time-lapse film af dyrkede Drosophila ægge kamre

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

En lagdelt monteringsmetode til forlænget tidsforskudt Konfokal mikroskopi af hele Zebrafish-embryoner

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...