Name: 3-d time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in the moss physcomitrium patens
Uploaded: 2023-02-10T14:10:00
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Os autores agradecem à Dra. Soucy Patricia e Betty Nunn, da Universidade de Louisville, pela assistência com o microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (1456884 a M.P.R.) e por um Acordo de Cooperação da National Science Foundation (1849213 a M.P.R.).

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a lista de materiais e equipamentos e a Tabela 1 para a lista de soluções a serem usadas neste protocolo.
1. Preparação de plantas para pratos de fundo de vidro
<ol><li>Cultivar o tecido protonemal de musgo em meio de ágar BCDAT em uma placa de Petri de 13 cm sob luz branca constante (~50 μmol m-2 s-1) por 7 dias a 25 °C na câmara de crescimento.</li>
	<li>Filtrar-esteri...

<ol>
	<li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+construction,+perception,+and+remodeling+of+plant+cell+walls.">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li><li>Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+integrity+maintenance+during+plant+development+and+interaction+with+the+environment.">Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment.</a> Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).</li><li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+function+of+ROP+GTPase+prenylation+important+for+multicellularity+in+the+moss+Physcomitrium+patens.">The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens.</a> Development. 149 (12), (2022).</li><li>Colin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+living+plant+cell:+From+probes+to+quantification.">Imaging the living plant cell: From probes to quantification.</a> The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).</li><li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+plants.">Live cell imaging of plants.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).</li><li>Goh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live-cell+imaging+approaches+to+study+lateral+root+formation+in+Arabidopsis+thaliana.">Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana.</a> Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).</li><li>Hamant, O., Das, P., Burian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+developing+shoot+meristems+using+a+confocal+laser+scanning+microscope.">Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).</li><li>Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+FM4-64,+a+tool+for+tracing+the+endocytic+pathways+in+Arabidopsis+root+cells.">Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).</li><li>Yagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+synthetic+fluorescent+probe+labeling+for+live-cell+imaging+in+plants.">Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).</li><li>Whitewoods, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLAVATA+was+a+genetic+novelty+for+the+morphological+innovation+of+3D+growth+in+land+plants.">CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants.</a> Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).</li><li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PSTAIRE-type+cyclin-dependent+kinase+controls+light+responses+in+land+plants.">A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants.</a> Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).</li></ol>

A reconstrução 3D de lapso de tempo, ou imagem 4D, é uma ferramenta poderosa para observar a dinâmica da morfologia celular durante os processos de desenvolvimento. Neste protocolo, misturando o branco calcofluor no meio, a dinâmica da morfologia celular 3D pode ser observada no musgo P. patens. Utilizando esse método, observamos que a superfície das paredes celulares em mutantes ggb é rasgada durante o desenvolvimento3. Além disso, o espessamento reduzido das paredes ce...

As paredes celulares das plantas sofrem alterações dinâmicas durante a expansão e o desenvolvimento celular 1,2,3. Manter a integridade da parede celular é fundamental para a adesão das células vegetais durante o crescimento e desenvolvimento, bem como para a resposta aos sinais ambientais. Embora a visualização da dinâmica da parede celular de células vivas durante um longo período de tempo seja fundamental para entender como a adesão celular é mantida durante o desenvolvimento e a adaptação às mudanças ambientais, os métodos atuais para observar diretamente a dinâmica da parede celular ainda são desafiadores.
A imagem de lapso de tempo de alterações celulares pode fornecer dinâmica de desenvolvimento informativa de um organismo usando um microscópio de fluorescência de alta resolução 4,5,6,7. Embora a imagem 3D de lapso de tempo tenha um grande potencial para estudar mudanças dinâmicas da forma celular durante o crescimento e desenvolvimento, a técnica normalmente requer a transformação de uma proteína fluorescente 4,5,6,7. No entanto, para a maioria dos sistemas, as transformações genéticas são demoradas ou tecnicamente desafiadoras. Como alternativa, os corantes fluorescentes que se ligam aos componentes celulares estão disponíveis há muito tempo. Os corantes fluorescentes podem emitir luz fluorescente após irradiação com luz de um certo comprimento de onda. Exemplos comuns são Edu, DAPI, PI, FM4-64 e calcofluor branco 8,9,10. Uma grande desvantagem, no entanto, é que esses corantes normalmente só podem ser usados em tecido fixo ou para experimentos curtos, em parte devido ao dano que causam à célula 8,9,10.
Com o protocolo aqui apresentado, os sinais de calcofluor são estáveis quando o calcofluor branco é misturado dentro do meio durante experimentos de lapso de tempo no musgo P. patens. Usando esse método, o descolamento de células em mutantes ggb usando imagens de lapso de tempo 3-D foi observado durante um período de 3 dias3 (Figura 1). Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas que contêm paredes celulares e que podem ser corados por calcofluor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-mm-thick red plastic light filter</td>
			<td>&#160;Mitsubishi</td>
			<td>&#160;no.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mm diameter glass base dish&#160;</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>3930-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>A6924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white&#160;</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td>Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>A1</td>
			<td>
			NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>TE200&#160;</td>
			<td>Equipped with a DS-U3 camera;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gellan gum&#160;</td>
			<td>Nacali Tesque</td>
			<td>12389-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Growth Chambers</td>
			<td>SANYO&#160;</td>
			<td>Sanyo MLR-350H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized syringe 0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in the moss physcomitrium patens

A imagem de lapso de tempo com microscopia de fluorescência permite a observação das mudanças dinâmicas de crescimento e desenvolvimento nos níveis celular e subcelular. Em geral, para observações durante um longo período, a técnica requer a transformação de uma proteína fluorescente; no entanto, para a maioria dos sistemas, a transformação genética é demorada ou tecnicamente indisponível. Este manuscrito apresenta um protocolo para imagem de time-lapse 3-D da dinâmica da parede celular durante um período de 3 dias usando corante calcofluor (que cora celulose na parede celular da planta), desenvolvido no musgo Physcomitrium patens. O sinal de corante calcofluor da parede celular é estável e pode durar 1 semana sem decaimento óbvio. Usando este método, foi demonstrado que o descolamento de células em mutantes ggb (nos quais a subunidade beta da proteína geranilgeraniltransferase-I é nocauteada) é causado por expansão celular desregulada e defeitos de integridade da parede celular. Além disso, os padrões de coloração de calcofluor mudam ao longo do tempo; regiões coradas menos intensamente correlacionam-se com os futuros locais de expansão/ramificação celular no tipo selvagem. Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas que contêm paredes celulares e que podem ser corados por calcofluor.

Esse método permite a observação da dinâmica da parede celular durante o desenvolvimento em mutantes do tipo selvagem e ggb (Figura 1). Os resultados mostraram que regiões com menor espessamento da parede celular se correlacionam com os locais de expansão/ramificação celular, permitindo a predição de locais de expansão/ramificação no tipo silvestre (Figura 1A). A superfície das paredes celulares em mutantes ggb foi rasgada durante...

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3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a imagem da dinâmica da parede celular 3D do tecido de musgo vivo, permitindo a visualização do descolamento das paredes celulares em mutantes ggb e do espessamento dos padrões da parede celular no tipo selvagem durante o desenvolvimento durante um longo período.

Imagem de lapso de tempo 3D da dinâmica da parede celular usando Calcofluor no musgo Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

A imagem de lapso de tempo com microscopia de fluorescência permite a observação das mudanças dinâmicas de crescimento e desenvolvimento nos níveis celular e subcelular. Este protocolo simples para imagens de lapso de tempo 3D pode estudar diretamente a dinâmica da parede celular durante um longo período. Este protocolo utiliza corante calcofluor para marcar a dinâmica da espessura da parede celular e, portanto, não requer uma transformação de uma proteína fluorescente.Os sinais de calcofluor são estáveis e podem durar mais de uma semana. Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas com estruturas simples contendo paredes celulares e pode ser corado por calcofluor, como em plantas com flores. Neste protocolo, os sinais de calcofluor são estáveis quando este corante é misturado dentro do meio durante todo o processo de imagem de lapso de tempo.Para começar, disperse o tecido de musgo de sete dias de idade em um microtubo de 1,5 mililitro contendo 20 microlitros de água esterilizada. Para o tipo selvagem use fórceps para separar os prótonos. Para o mutante ggb, separe os protonatos usando a pipeta AP-1000.Adicione 10 microlitros do calcofluor-branco esterilizado no microtubo e deixe o tubo ereto no exaustor por dois minutos para colorir. Imediatamente após a coloração, misture as plantas com 200 microlitros de BCDATG resfriado contendo meio BCDAT pipetando cinco vezes com uma pipeta P1000 e transfira a mistura para um prato de base de vidro de 27 milímetros. Certifique-se de que os 200 microlitros de BCDATG com amostras sejam distribuídos uniformemente na superfície do prato de fundo de vidro de 27 milímetros para produzir uma fina camada de filme para que as amostras estejam dentro da distância de trabalho objetiva durante a imagem.Depois de solidificar por dois minutos à temperatura ambiente, cubra a camada fina com três mililitros de BCDATG resfriado e deixe ajustar por 10 minutos para solidificar novamente. Na parte inferior do prato, desenhe nove linhas cada em direções paralelas e perpendiculares e marque as linhas com caracteres de A a H e as colunas com números de um a oito. Use superior, inferior, direita, meio e esquerda para marcar as posições dentro de cada quadrado.Por exemplo, se uma planta está em um quadrado na segunda linha, na sexta coluna e está posicionada na parte superior esquerda do quadrado, então essa planta recebe o nome de b6 no canto superior esquerdo. Coloque o prato com fundo de vidro sob luz branca por um a dois dias antes de ser submetido a imagens de lapso de tempo todos os dias, por até três dias. Para reconstruir as imagens 3D, abra o arquivo ND2 e clique em volume.Reconstrua a parede celular no dia zero, no primeiro dia, no terceiro dia e no quarto dia. Depois de tirar cada imagem, coloque o prato à base de vidro de volta na câmara de cultivo. Mudanças dinâmicas nas paredes transversais foram demonstradas pela coloração branco-calcofluor no tipo selvagem e mutantes ggb.Para os mutantes ggb, as linhas tracejadas brancas abaixo de cada imagem indicam a parede celular da superfície quebrada nas células em expansão e as linhas laranjas indicam as células abaixo da superfície da parede celular em ggb. As diferenças no sinal calcofluor-branco podem ser detectadas nas posições superficiais das células e regiões menos densamente coradas indicaram expansão celular em mutantes ggb ou locais recém-ramificados no tipo selvagem. Para a pré-cultura do tipo selvagem, as plantas em luz vermelha fraca do acima por cinco dias são necessárias para induzir as respostas fototrópicas dos protonatos, de modo que as plantas possam ser anexadas ao fundo dos pratos e as plantas possam emergir dentro da distância objetiva de trabalho durante a imagem, porque o calcofluor-branco pode ser usado com outro corante, como a microesfera.Informações adicionais sobre a expansão celular também podem ser estudadas. A dinâmica da parede celular da planta é fundamental para o crescimento e desenvolvimento eficiente, bem como para a resposta ao sinal ambiental. Este protocolo permite a divisão direta de alterações nos sinais da parede celular e na integração.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Biologia do Desenvolvimento

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Produção e Administração de Therapeutic-tronco mesenquimais / celular estromal (MSC) Spheroids condicionadas em culturas 3-D Sob Condições Xeno-livres

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

A<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método for Imaging Time-Lapse of cultivadas Rato Mesentéricas microvasculares Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...