Name: 3-d time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in the moss physcomitrium patens
Uploaded: 2023-02-10T14:10:00
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Soucy Patricia y Betty Nunn de la Universidad de Louisville por su ayuda con el microscopio confocal. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (1456884 a M.P.R.) y por un Acuerdo de Cooperación de la National Science Foundation (1849213 a M.P.R.).

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para la lista de materiales y equipos y la Tabla 1 para la lista de soluciones que se utilizarán en este protocolo.
1. Preparación de plantas para platos con fondo de cristal.
<ol><li>Cultivar el tejido protonemal de musgo en medio de agar BCDAT en una placa de Petri de 13 cm bajo luz blanca constante (~50 μmol m-2 s-1) durante 7 días a 25 °C en la cámara de crecimiento.</li>
...

<ol>
	<li>Anderson, C. T., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+construction,+perception,+and+remodeling+of+plant+cell+walls.">Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls.</a> Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).</li><li>Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+integrity+maintenance+during+plant+development+and+interaction+with+the+environment.">Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment.</a> Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).</li><li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+function+of+ROP+GTPase+prenylation+important+for+multicellularity+in+the+moss+Physcomitrium+patens.">The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens.</a> Development. 149 (12), (2022).</li><li>Colin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+living+plant+cell:+From+probes+to+quantification.">Imaging the living plant cell: From probes to quantification.</a> The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).</li><li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+plants.">Live cell imaging of plants.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).</li><li>Goh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live-cell+imaging+approaches+to+study+lateral+root+formation+in+Arabidopsis+thaliana.">Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana.</a> Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).</li><li>Hamant, O., Das, P., Burian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+developing+shoot+meristems+using+a+confocal+laser+scanning+microscope.">Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).</li><li>Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+of+FM4-64,+a+tool+for+tracing+the+endocytic+pathways+in+Arabidopsis+root+cells.">Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).</li><li>Yagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+synthetic+fluorescent+probe+labeling+for+live-cell+imaging+in+plants.">Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).</li><li>Whitewoods, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLAVATA+was+a+genetic+novelty+for+the+morphological+innovation+of+3D+growth+in+land+plants.">CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants.</a> Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).</li><li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PSTAIRE-type+cyclin-dependent+kinase+controls+light+responses+in+land+plants.">A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants.</a> Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).</li></ol>

La reconstrucción 3D de lapso de tiempo, o imágenes 4D, es una herramienta poderosa para observar la dinámica de la morfología celular durante los procesos de desarrollo. En este protocolo, al mezclar el blanco de calcofluor en el medio, se puede observar la dinámica de la morfología celular 3D en el musgo P. patens. Usando este método, observamos que la superficie de las paredes celulares en los mutantes ggb se desgarra durante el desarrollo3. Además, el engrosamiento re...

Las paredes celulares de las plantas experimentan cambios dinámicos durante la expansión y el desarrollo celular 1,2,3. Mantener la integridad de la pared celular es fundamental para la adhesión de las células vegetales durante el crecimiento y el desarrollo, así como para la respuesta a las señales ambientales. Aunque visualizar la dinámica de la pared celular de las células vivas durante un largo período de tiempo es fundamental para comprender cómo se mantiene la adhesión celular durante el desarrollo y la adaptación a los cambios ambientales, los métodos actuales para observar directamente la dinámica de la pared celular siguen siendo un desafío.
Las imágenes de lapso de tiempo de los cambios celulares pueden proporcionar una dinámica informativa del desarrollo de un organismo utilizando un microscopio de fluorescencia de alta resolución 4,5,6,7. Si bien las imágenes 3D de lapso de tiempo tienen un gran potencial para estudiar los cambios dinámicos de la forma celular durante el crecimiento y el desarrollo, la técnica normalmente requiere la transformación de una proteína fluorescente 4,5,6,7. Sin embargo, para la mayoría de los sistemas, las transformaciones genéticas requieren mucho tiempo o son técnicamente desafiantes. Como alternativa, los tintes fluorescentes que se adhieren a los componentes celulares han estado disponibles durante mucho tiempo. Los colorantes fluorescentes pueden emitir luz fluorescente después de la irradiación con luz de cierta longitud de onda. Ejemplos comunes son Edu, DAPI, PI, FM4-64 y calcofluor blanco 8,9,10. Un inconveniente importante, sin embargo, es que estos colorantes generalmente solo se pueden usar en tejido fijo o para experimentos cortos, en parte debido al daño que causan a la célula 8,9,10.
Con el protocolo presentado aquí, las señales de calcofluor son estables cuando el blanco de calcofluor se mezcla dentro del medio durante los experimentos de lapso de tiempo en el musgo P. patens. Usando este método, se observó el desprendimiento de células en mutantes ggb utilizando imágenes de lapso de tiempo 3D durante un período de 3 días3 (Figura 1). Este método se puede aplicar a muchos otros sistemas que contienen paredes celulares y que pueden ser teñidos por calcofluor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-mm-thick red plastic light filter</td>
			<td>&#160;Mitsubishi</td>
			<td>&#160;no.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 mm diameter glass base dish&#160;</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>3930-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>A6924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white&#160;</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td>Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>A1</td>
			<td>
			NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. 
			com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>TE200&#160;</td>
			<td>Equipped with a DS-U3 camera;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gellan gum&#160;</td>
			<td>Nacali Tesque</td>
			<td>12389-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Growth Chambers</td>
			<td>SANYO&#160;</td>
			<td>Sanyo MLR-350H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized syringe 0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in the moss physcomitrium patens

Las imágenes de lapso de tiempo con microscopía de fluorescencia permiten observar los cambios dinámicos de crecimiento y desarrollo a nivel celular y subcelular. En general, para observaciones durante un período prolongado, la técnica requiere la transformación de una proteína fluorescente; Sin embargo, para la mayoría de los sistemas, la transformación genética requiere mucho tiempo o no está técnicamente disponible. Este manuscrito presenta un protocolo para imágenes de lapso de tiempo 3D de la dinámica de la pared celular durante un período de 3 días utilizando colorante calcofluor (que tiñe la celulosa en la pared celular de la planta), desarrollado en el musgo Physcomitrium patens. La señal de colorante calcofluor de la pared celular es estable y puede durar 1 semana sin descomposición obvia. Usando este método, se ha demostrado que el desprendimiento de células en mutantes ggb (en el que la proteína geranilgeraniltransferasa-I subunidad beta es eliminada) es causado por la expansión celular no regulada y defectos de integridad de la pared celular. Además, los patrones de tinción de calcofluor cambian con el tiempo; Las regiones menos intensamente teñidas se correlacionan con los futuros sitios de expansión / ramificación celular en el tipo silvestre. Este método se puede aplicar a muchos otros sistemas que contienen paredes celulares y que pueden ser teñidos por calcofluor.

Este método permite la observación de la dinámica de la pared celular durante el desarrollo en mutantes de tipo salvaje y ggb (Figura 1). Los resultados mostraron que las regiones con menos engrosamiento de la pared celular se correlacionan con los sitios de expansión/ramificación celular, lo que permite la predicción de sitios de expansión/ramificación en el tipo salvaje (Figura 1A). La superficie de las paredes celulares en los mutantes gg...

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3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Este manuscrito presenta un protocolo detallado para obtener imágenes de la dinámica de la pared celular 3D del tejido de musgo vivo, lo que permite la visualización del desprendimiento de las paredes celulares en mutantes ggb y engrosar los patrones de pared celular en el tipo salvaje durante el desarrollo durante un largo período.

Imágenes de lapso de tiempo 3D de la dinámica de la pared celular usando calcofluor en musgo Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

Las imágenes de lapso de tiempo con microscopía de fluorescencia permiten observar los cambios dinámicos de crecimiento y desarrollo a nivel celular y subcelular. Este sencillo protocolo para imágenes de lapso de tiempo 3D puede estudiar directamente la dinámica de la pared celular durante un largo período. Este protocolo utiliza colorante calcofluor para marcar la dinámica del grosor de la pared celular y, por lo tanto, no requiere una transformación de una proteína fluorescente.Las señales de calcofluor son estables y pueden durar más de una semana. Este método se puede aplicar a muchos otros sistemas con estructuras simples que contienen paredes celulares y puede ser teñido por calcofluor, como en las plantas con flores. En este protocolo, las señales de calcofluor son estables cuando este colorante se mezcla dentro del medio durante todo el proceso de imágenes de lapso de tiempo.Para comenzar, disperse el tejido de musgo de siete días en un microtubo de 1,5 mililitros que contenga 20 microlitros de agua esterilizada. Para el tipo salvaje use fórceps para separar los protonemata. Para el mutante ggb, separe el protonemata usando pipeta AP-1000.Agregue 10 microlitros del calcofluor-blanco esterilizado en el microtubo y deje el tubo en posición vertical en la campana durante dos minutos para teñir. Inmediatamente después de la tinción, mezcle las plantas con 200 microlitros de BCDATG enfriado que contenga medio BCDAT pipeteando cinco veces con una pipeta P1000 y transfiera la mezcla a un plato base de vidrio de 27 milímetros. Asegúrese de que los 200 microlitros de BCDATG con muestras se distribuyan uniformemente en la superficie del plato de fondo de vidrio de 27 milímetros para producir una capa delgada de película de modo que las muestras estén dentro de la distancia de trabajo objetivo durante la toma de imágenes.Después de solidificar durante dos minutos a temperatura ambiente, cubra la capa delgada con tres mililitros de BCDATG enfriado y déjela reposar durante 10 minutos para que se solidifique nuevamente. En la parte inferior del plato, dibuje nueve líneas cada una en direcciones paralelas y perpendiculares y marque las filas con caracteres de la A a la H, y las columnas con números del uno al ocho. Use superior, inferior, derecha, medio e izquierda para marcar las posiciones dentro de cada cuadrado.Por ejemplo, si una planta está en un cuadrado en la segunda fila, en la sexta columna y se coloca en la parte superior izquierda del cuadrado, entonces esta planta recibe el nombre de b6 superior izquierda. Coloque el plato con fondo de vidrio bajo luz blanca durante uno o dos días antes de ser sometido a imágenes de lapso de tiempo todos los días, hasta por tres días. Para reconstruir las imágenes 3D, abra el archivo ND2 y haga clic en volumen.Reconstruya la pared celular en el día cero, el día uno, el día tres y el día cuatro. Después de tomar cada imagen, vuelve a colocar el plato a base de vidrio en la cámara de cultivo. Los cambios dinámicos en las paredes cruzadas se mostraron mediante tinción de blanco calcofluor en mutantes de tipo salvaje y ggb.Para los mutantes ggb, las líneas discontinuas blancas debajo de cada imagen indican la pared celular de la superficie rota en las celdas en expansión y las líneas naranjas indican las celdas debajo de la superficie de la pared celular en ggb. Las diferencias en la señal de blanco calcofluorado se pueden detectar en las posiciones superficiales de las células y las regiones menos densamente teñidas indicaron expansión celular en mutantes ggb o sitios de nueva ramificación en el tipo salvaje. Para el precultivo de tipo silvestre, se requiere que las plantas en luz roja débil de lo anterior durante cinco días induzcan las respuestas fototrópicas de protonemata para que las plantas puedan adherirse al fondo de los platos y las plantas puedan emerger dentro de la distancia de trabajo ascendente objetiva durante la obtención de imágenes porque el blanco de calcofluor se puede usar con otro tinte como la microesfera.También se puede estudiar información adicional sobre la expansión celular. La dinámica de la pared celular de la planta es fundamental para el crecimiento y desarrollo eficientes, así como para la respuesta a la señal ambiental. Este protocolo permite la división directa de los cambios en las señales de la pared celular y la integración.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Producción y Administración de la terapéutica madre mesenquimales / célula del estroma (MSC) esferoides imprimado en 3-D Los cultivos bajo condiciones Xeno-libres

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método para time-lapse de rata cultivadas mesentéricas microvasculares Redes

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Sola célula cuantificación de las tasas de degradación de proteína por microscopia de fluorescencia Time-lapse en cultivo de células adherentes

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

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En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Análisis de la dinámica de Actomyosin en escalas celulares y de tejidos locales utilizando películas de lapso de tiempo de cámaras de huevo de Drosophila cultivada

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...