Name: an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures at JoVE.com

Denne undersøgelse blev foretaget i samarbejde med BASF Beauty Care Solutions. Charlie Colin-Pierre er en BASF / CNRS-finansieret ph.d.-stipendiat.
Vi vil gerne takke Mr. Mehdi Sellami for udformningen af de 3D-printede skær.

BEMÆRK: 3D-indsatserne (figur 1A) er kommercielt indkøbt og udskrives ved hjælp af en fotopolymerharpiks, der er biokompatibel med cellekultur og autoklavering (se materialetabellen). I dette afsnit beskrives en detaljeret protokol til etablering af samkulturmodellen ved hjælp af inserts (se figur 1B). Der gives også nogle eksempler på applikationer.
1. Placering af den steriliserede indsats i 6-brøndplad...

<ol>
	<li>Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+understanding+heterotypic+interactions+in+multi-culture+models+of+breast+cancer.">Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer.</a> Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).</li><li>Do&#287;an, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+isolation+from+pulp+tissue+and+co-culture+with+cancer+cells+to+study+their+interactions.">Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+UBE2CP3+enhances+HCC+cell+secretion+of+VEGFA+and+promotes+angiogenesis+by+activating+ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA+signalling+in+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).</li><li>Soares, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+modulation+of+microglia-neuron+communication:+Anti-neuroinflammatory+and+neurotrophic+role.">Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role.</a> Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).</li><li>Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+promotes+the+formation+of+dense,+interconnected+endothelial+networks.">Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks.</a> Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+preclinical+model+of+osteoclastogenesis+from+peripheral+blood+monocytes+co-cultured+with+breast+cancer+cell+lines.">Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).</li><li>Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+effect+of+air+particles+exposure+induce+Nrf2-dependent+cardiomyocyte+cellular+response+in+vitro.">Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro.</a> Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).</li><li>Colin-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glypican-1/HGF/C-met+and+glypican-1/VEGF/VEGFR2+ternary+complexes+regulate+hair+follicle+angiogenesis.">The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).</li><li>Toubal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NC1+domain+of+type+XIX+collagen+inhibits+melanoma+cell+migration.">The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration.</a> European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).</li><li>Wu, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+growth+factors+and+internal+limiting+membrane+constituents+in+m&#252;ller+cell+migration.">Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in m&#252;ller cell migration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).</li><li>Oudart, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+releases+the+anti-tumor+peptide+from+the+NC1+domain+of+collagen+XIX.">Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX.</a> Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).</li><li>Martinotti, S., Ranzato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratch+wound+healing+assay.">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).</li><li>Cattin, S., Ramont, L., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+in+vivo+validation+of+a+three-dimensional+multi-cellular+culture+model+to+study+heterotypic+interactions+in+colorectal+cancer+cell+growth,+invasion+and+metastasis.">Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).</li><li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle.">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li></ol>

Indirekte cellekommunikation undersøges almindeligvis ved hjælp af konditionerede medier eller co-kultursystemenheder. Konditioneret medieforberedelse er tidskrævende opstrøms i forsøgene, og denne metode er begrænset til ensidige effektanalyser. Den tidligere undersøgelse af Colin-Pierre et al.8 ved hjælp af konditionerede medier blev udført på den indirekte cellekommunikation mellem to celletyper (HDMEC'er og KORS). Dataene fra denne tidligere undersøgelse viste effekten af K...

In vivo kommunikerer celler med hinanden enten direkte (cellekontakt) eller indirekte (ved udskillelse af molekyler). For at studere cellekommunikation kan der udvikles forskellige samkulturmodeller, såsom direkte samkultur (de forskellige celletyper er i direkte interaktion i samme brønd) og opdelt samkultur (de forskellige celletyper er i indirekte interaktion i forskellige rum i et kultursystem)1. Desuden kan konditionerede medier anvendes til samkultursystemer, hvor den indirekte interaktion muliggøres af udskillede molekyler indeholdt i det konditionerede medie af en effektorcelletype, der overføres til en respondercelletype1.
I tilfælde af parakrin cellekommunikationsundersøgelser giver indirekte samkultursystemer modeller, der stærkt afspejler celleinteraktioner in vivo. Indirekte samkultursystemer er blevet udviklet og kommercialiseret, hvilket muliggør etablering af indirekte samkulturmodeller 2,3. Desværre giver de fleste indirekte samkultursystemer kun to rum. Andre indirekte samkultursystemer giver flere rum, men de er mindre skalerbare sammenlignet med det system, der er rapporteret i dette manuskript. Nogle af dem tillader ikke en klassisk visualisering under et mikroskop, og de præsenterer ofte specifikke applikationsmetoder. I flere undersøgelser undersøges den parakrinkommunikation mellem forskellige celletyper ved hjælp af den konditionerede mediemodel 4,5,6,7. Dette er en lettere måde at undersøge sammenlignet med indirekte samkultursystemer, fordi det ikke kræver, at der fastlægges specifikke metoder eller materialer1. På den anden side er forberedelsen af konditionerede medier tidskrævende og giver kun information om envejs cellesignalering (effektor til responder)1.
I dette papir foreslås en ny, enkel måde at undersøge cellekommunikation på. Ved at tillade kombinationen af flere celletyper i direkte eller indirekte interaktion og i 2D- eller 3D-formater giver de trykte skær adskillige fordele ved let at oprette samkulturmodeller. Den 3D-printede indsats er tilpasset til at blive placeret i brøndene på 6-brøndsplader og er cirkulær og tillader adskillelse af brønden i fire rum (to store rum og to små rum; Figur 1A). De 3D-printede skær er kendetegnet ved fraværet af en bund. Således er cellerne i direkte kontakt med pladen, hvorpå indsatsen er placeret. Derudover kan hvert rum belægges uafhængigt af de andre. Desuden kan celleadfærden let følges under optiske mikroskoper. Tilstedeværelsen af kommunikationsvinduer i hver væg af indsatsen tillader tilsætning på det optimale tidspunkt af et fælles medium til at udføre forskellige eksperimenter med samkultur. Talrige kombinationer af co-kultur kan udføres for at studere direkte og / eller indirekte kommunikation mellem flere celletyper. For eksempel kan der designes en model af indirekte samkultur mellem fire forskellige celletyper i monolag og/eller i 3D (sfæroider). En kombination af direkte og indirekte samkulturmodeller kan også udføres ved at blande forskellige celletyper i samme rum. Effekten af komplekse strukturer (organoider, vævseksplantat osv.) på forskellige celletyper kunne være et andet eksempel på modeller, der kan laves. Desuden er de 3D-printede indsatser kompatible med cellebiologiske funktionelle assays (proliferation, migration, pseudorørdannelse, differentiering osv.) og med biokemiske tests (ekstraktion af DNA, RNA, protein, lipider osv.). Endelig giver de 3D-printede skær en bred vifte af eksperimentelle skemaer af samkulturmodeller med mulighed for at kombinere samtidigt forskellige assays i det samme eksperiment i de forskellige rum.
Nogle kapaciteter af de 3D-printede skær præsenteres for at validere dem som en hurtig og brugervenlig samkulturmodel. I sammenligning med et tidligere publiceret studie af parakrin cellekommunikation demonstreres de 3D-printede inserters evne til at være en værdifuld samkulturmodel. For at vurdere dette punkt blev reguleringen af endotelcelleproliferation og migration af keratinocytter sammenlignet mellem det 3D-printede indsatssystem og det klassiske system ved hjælp af konditionerede medier. De 3D-printede skær giver mulighed for hurtigt at opnå lignende resultater sammenlignet med det konventionelle system ved hjælp af konditionerede medier. Faktisk giver de 3D-printede indsatser en robust model til at studere celleinteraktioner i begge retninger uden behov for at producere konditionerede medier og med mulighed for parallelt at udføre sprednings- og migrationsassays i samme eksperiment.
Afslutningsvis foreslås i dette papir en ny og klar til brug model til undersøgelse af cellekommunikation. De 3D-printede indsatser er kompatible med alle klæbende celletyper og giver mulighed for at udføre adskillige kombinationer af samkultur, der sigter mod at være tættere på in vivo-forhold .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Getinge</td>
			<td>APHP</td>
			<td>Solid cycle, 121 &#176;C for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomed Clear</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-BMCL-01</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture detergents&#160;</td>
			<td>Tounett</td>
			<td>A18590/0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11,64,48,07,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slide</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EVE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture-Insert 2 Well in &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80206</td>
			<td>two-migration chambers device.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001</td>
			<td>Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated cell counter&#160;</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>NESCT-EVE-001E&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1200</td>
			<td>10x of magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food silicon reagent and catalyst kit</td>
			<td>Artificina</td>
			<td>RTV 3428 A and B&#160;</td>
			<td>(10:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORM 3B printer</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro Wound Healing Tool Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal stem cell medium&#160;</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>7501</td>
			<td>Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader SPECTRO star NANO</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>BMG LABTECH software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-40232</td>
			<td>Without Ca2+ / Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td>Incubation of KORS at 37 &#176;C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures

De klassiske analyser af indirekte kommunikation mellem forskellige celletyper nødvendiggør brug af konditionerede medier. Desuden forbliver produktionen af konditionerede medier tidskrævende og langt fra fysiologiske og patologiske tilstande. Selv om nogle få modeller af co-kultur er kommercielt tilgængelige, forbliver de begrænset til specifikke assays og er for det meste for to typer celler. 
Her anvendes 3D-printede skær, der er kompatible med adskillige funktionelle assays. Indsatsen tillader adskillelse af en brønd i en 6-brøndplade i fire rum. En bred vifte af kombinationer kan indstilles. Desuden er vinduer designet i hver væg i rummene, så potentiel intercellulær kommunikation mellem hvert rum er mulig i kulturmediet på en volumenafhængig måde. For eksempel kan parakrin intercellulær kommunikation studeres mellem fire celletyper i monolag, i 3D (sfæroider) eller ved at kombinere begge. Derudover kan en blanding af forskellige celletyper podes i samme rum i 2D- eller 3D-format (organoider). Fraværet af en bund i de 3D-printede skær tillader de sædvanlige dyrkningsforhold på pladen, mulig belægning på pladen, der indeholder indsatsen, og direkte visualisering ved optisk mikroskopi. De mange rum giver mulighed for at indsamle forskellige celletyper uafhængigt eller i hvert rum anvende forskellige reagenser til RNA- eller proteinekstraktion. I denne undersøgelse gives en detaljeret metode til at bruge det nye 3D-printede skær som et samkultursystem. For at demonstrere flere kapaciteter i denne fleksible og enkle model blev tidligere offentliggjorte funktionelle assays af cellekommunikation udført i de nye 3D-printede indsatser og blev demonstreret at være reproducerbare. De 3D-printede indsatser og den konventionelle cellekultur ved hjælp af konditionerede medier førte til lignende resultater. Afslutningsvis er den 3D-printede indsats en simpel enhed, der kan tilpasses adskillige modeller af cokulturer med klæbende celletyper.

I dette arbejde blev der beskrevet et optimeret samkultursystem for at opnå robuste, pålidelige og signifikante data, der kan sammenlignes med klassiske metoder ved brug af konditionerede medier. De 3D-printede skær efterligner in vivo-mikromiljøforholdene for forskellige celletyper i interaktion ved at overvinde vanskelighederne og den tidskrævende produktion af konditionerede medier opstrøms i eksperimenterne. En tidligere offentliggjort undersøgelse er blevet regennemført for at analysere de indirekte...

Watch this Scientific Journal Video about An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures at JoVE.com

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

I dette papir præsenteres en nydesignet 3D-printet indsats som en model for co-kultur og valideres gennem undersøgelsen af den parakrin intercellulære kommunikation mellem endotelceller og keratinocytter.

Et innovativt 3D-printet skær designet til at muliggøre enkle 2D- og 3D-cellekulturer

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Denne protokol kan bruges til at undersøge adskillige kulturstudier og give et nyt værktøj til at undersøge direkte cellekommunikation. Denne nye enhed sparer betydelig tid ved etablering af en kulturmodel og kan anvendes til forskellige celletyper, der kræver en bestemt belægning eller ej. Faktisk giver de fire rum i de 3D-printede indsatser mulighed for at dyrke forskellige celletyper i monolag eller i 3D på samme måde med forskellige kombinationer.De 3D-printede skær er mere holdbare, fleksible, skalerbare og kan bruges til at designe eksperimentelle modeller til studier af fysiopatologier, såsom immunologi eller androgenese. Til at begynde med blandes de to komponenter, madsilicium og katalysator, der leveres i sættet, i et forhold på 10: 1 ved hjælp af en 70% ethanolsteriliseret spatel i henhold til producentens anvisninger. Påfør indsatserne på silikoneblandingen med pincet, så blandingen fordeles homogent ved indsatsens nederste kant.Skærene anbringes i hullerne på en plade med seks brønde, og tryk let for at sikre, at indsatserne er i tæt kontakt med pladen for at undgå lækage af cellekulturmediet. Sæt pladen ved 37 grader Celsius for at understøtte siliciumets størkningsproces i en time. Efter størkning steriliseres pladerne med indsatserne ved at nedsænke dem i et 70% ethanolbad i 30 minutter til en time.Kassér derefter alkoholen ved pipettering, og lad pladen tørre natten over i en cellekulturhætte. For at dyrke keratinocytterne i den ydre rodkappe og humane dermale mikrovaskulære endotelceller kasseres mediet fra kolberne og tilsættes fem ml trypsin for at løsne cellerne. Kolben indeholdende keratinocytterne i den ydre rodkappe anbringes ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i fem minutter, og kolben indeholdende de humane dermale mikrovaskulære endotelceller inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur.I et 15 ml sterilt konisk rør blandes trypsinopløsningen indeholdende keratinocytterne i den ydre rodkappe med fem ml mesenkymstamcellemedium suppleret med 5% FBS og vækstfaktorer og de humane dermale mikrovaskulære endotelceller med fem ml endotelcellemedium suppleret med 5% FBS og vækstfaktorer. Keratinocytterne i den ydre rodkappe og humane dermale mikrovaskulære endotelcellesuspensioner centrifugeres ved 200 G i fem minutter ved stuetemperatur. Efter at supernatanten er kasseret, resuspenderes cellerne i to ml af deres respektive substrater.Bland 10 mikroliter af cellesuspensionen med 10 mikroliter trypanblåt farvestof, og tilsæt 10 mikroliter af blandingen i tællekammeret. Indsæt tællediaset i celletællingssystemet, og registrer cellenummeret og levedygtigheden. Efter fremstilling af cellesuspensionen i en koncentration på 50.000 celler pr. milliliter i det respektive medium fordeles 800 mikroliter til en milliliter af cellesuspensionen i de enkelte store rum og 100 til 150 mikroliter i de enkelte små rum med en pipette.Se keratinocytterne i mesenkymale stamcellemedier suppleret med 5%FBS og vækstfaktorer og humane dermale mikrovaskulære endotelceller i endotelcellemedium, suppleret med 5%FBS og vækstfaktorer i de små og andre store rum. Placer cellekulturpladen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid eller under de sædvanlige betingelser for at muliggøre celleadhæsion og eller modning. Tøm kulturmediet i indsatsens forskellige rum ved hjælp af en pipette.Skyl derefter cellerne med en milliliter 37 grader varm PBS i de store rum og 200 mikroliter i de små rum. Tilsæt tre milliliter af et fælles medium valgt til at være kompatibelt for alle celletyper. Pladen med co-kulturerne anbringes ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 24 til 48 timer.Fjern cellerne ved hjælp af trypsin til cellesuspensionstælling, og kontroller levedygtigheden ved hjælp af trypanblå farvning. Efter observation af morfologien tælles cellenummeret på de forskellige rum under eksperimentet under et optisk mikroskop efter 24 til 48 timers inkubation. Fjern først indsatserne fra de seks brøndplader i slutningen af eksperimentet med en let drejning, og fjern derefter silicium fra indsatserne ved at trække det af.Vask indsatserne med konventionelle cellekulturvaskemidler og rengøringsmaterialer. Derefter steriliseres indsatserne til fremtidig brug i en autoklave eller ved at nedsænke dem i et 70% ethanolbad i en time. Fænotypen og cellelevedygtigheden blev sammenlignet, hvor 90% levedygtighed blev observeret i brøndene i de seks brøndplader, og ved 91% blev observeret i de 3D-printede indsatser til keratinocytter i den ydre rodkappe.Levedygtigheden af humane dermale mikrovaskulære endotelceller var 85% i brøndene i de seks brøndplader, mens 86% i de 3D-printede indsatser. Den indirekte cellekommunikation mellem keratinocytter og endotelceller i de 3D-printede inserter viste, at i nærvær af keratinocytter i inserterne steg de humane dermale mikrovaskulære endotelcellers proliferation signifikant med 1,5 gange efter 24 timer og med 3,1 gange efter 48 timer sammenlignet med kontrollen. Keratinocytten i det ydre rodkappetilstandsmedium viste sig imidlertid signifikant at øge human dermal mikrovaskulær endotelcelleproliferation med 1,5 gange efter 24 timer og med 2,1 gange efter 48 timer.Den 3D-printede insert-cokulturmodel blev testet for at bestemme effekten af keratinocytter på human dermal mikrovaskulær endotelcellemigration. I kontroltilstanden migrerede endotelceller og dækkede ca. 44% af sårområdet efter 24 timer. I nærvær af keratinocytter blev der observeret en signifikant stigning i human dermal mikrovaskulær endotelcellemigration, hvilket viser, at 43% 67% og 99% af sårområdet var dækket efter henholdsvis tre, 12 og 24 timer.Tilsvarende øges migrationen af HDMEC'er i nærvær af keratinocytter af det ydre rodkappetilstandsmedium. Det er afgørende at sikre forseglingen af indsatsen til pladen for at forhindre lækage af cellemediet fra et rum til et andet. Flere anvendelser kunne foretages, såsom spredning, migration, beroligende dannelsesassays DNA, RNA, protein og anden analyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

En innovativ metode til exosome Kvantificering og størrelse måling

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Udvikling af en Insert Co-kultur System af to Cellular typer i fravær af celle-celle-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

En effektiv og fleksibel Cell Sammenlægning Metode til 3D Sfæroide Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Etablering af en ekstracellulære sure pH kultur System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

En 3D-printet pollenfælde til humlebi(Bombus)Hive Indgange

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

Intravital billeddannelse ved hjælp af et omvendt mikroskop til at spore hudcelledynamik

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Forfatter Spotlight: Udvikling af et værktøj til brug af inverterede konfokale mikroskoper til in vivo intravital billeddannelse 

Strømlinet intravital billeddannelsesmetode til langsigtet overvågning af epitelvævsdynamik på et inverteret konfokalmikroskop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...