Name: an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00
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이 연구는 BASF Beauty Care Solutions와 공동으로 이루어졌습니다. Charlie Colin-Pierre는 BASF / CNRS가 후원하는 박사 학위 펠로우입니다.
3D 프린팅 인서트의 개념에 대해 Mr. Mehdi Sellami에게 감사드립니다.

참고: 3D 인서트(그림 1A)는 상업적으로 조달되며 세포 배양 및 오토클레이빙에 생체 적합성이 있는 포토폴리머 수지를 사용하여 인쇄됩니다( 재료 표 참조). 이 섹션에서는 인서트를 통해 공동 배양 모델을 설정하는 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다( 그림 1B 참조). 응용 프로그램의 몇 가지 예도 제공됩니다.
1. ?...

<ol>
	<li>Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+towards+understanding+heterotypic+interactions+in+multi-culture+models+of+breast+cancer.">Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer.</a> Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).</li><li>Do&#287;an, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., &#350;ahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+isolation+from+pulp+tissue+and+co-culture+with+cancer+cells+to+study+their+interactions.">Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+UBE2CP3+enhances+HCC+cell+secretion+of+VEGFA+and+promotes+angiogenesis+by+activating+ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA+signalling+in+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1&#945;/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).</li><li>Soares, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+modulation+of+microglia-neuron+communication:+Anti-neuroinflammatory+and+neurotrophic+role.">Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role.</a> Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).</li><li>Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropoelastin+promotes+the+formation+of+dense,+interconnected+endothelial+networks.">Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks.</a> Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).</li><li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+preclinical+model+of+osteoclastogenesis+from+peripheral+blood+monocytes+co-cultured+with+breast+cancer+cell+lines.">Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).</li><li>Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+effect+of+air+particles+exposure+induce+Nrf2-dependent+cardiomyocyte+cellular+response+in+vitro.">Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro.</a> Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).</li><li>Colin-Pierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glypican-1/HGF/C-met+and+glypican-1/VEGF/VEGFR2+ternary+complexes+regulate+hair+follicle+angiogenesis.">The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).</li><li>Toubal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NC1+domain+of+type+XIX+collagen+inhibits+melanoma+cell+migration.">The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration.</a> European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).</li><li>Wu, A. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+growth+factors+and+internal+limiting+membrane+constituents+in+m&#252;ller+cell+migration.">Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in m&#252;ller cell migration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).</li><li>Oudart, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+releases+the+anti-tumor+peptide+from+the+NC1+domain+of+collagen+XIX.">Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX.</a> Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).</li><li>Martinotti, S., Ranzato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratch+wound+healing+assay.">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).</li><li>Cattin, S., Ramont, L., R&#252;egg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+in+vivo+validation+of+a+three-dimensional+multi-cellular+culture+model+to+study+heterotypic+interactions+in+colorectal+cancer+cell+growth,+invasion+and+metastasis.">Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).</li><li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle.">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li></ol>

간접 세포 통신은 일반적으로 조건화된 배지 또는 공동 배양 시스템 장치를 사용하여 조사됩니다. 조건화된 배지 준비는 실험의 업스트림에서 시간이 많이 소요되며, 이 방법은 단측 효과 분석으로 제한됩니다. Colin-Pierre et al.의 이전 연구.8 컨디셔닝 배지를 사용하여 두 세포 유형(HDMEC 및 KORS) 간의 간접 세포 통신에 대해 수행되었습니다. 이 이전 연구의 데이터는 HDMEC 증?...

생체 내에서 세포는 직접적으로(세포 접촉) 또는 간접적으로(분자 분비에 의해) 서로 통신합니다. 세포 통신을 연구하기 위해 직접 공동 배양(서로 다른 세포 유형이 동일한 웰에서 직접 상호 작용함) 및 구획화된 공동 배양(서로 다른 세포 유형이 배양 시스템의 서로 다른 구획에서 간접 상호 작용함)과 같은 다양한 공동 배양 모델을 개발할 수 있습니다1. 또한, 컨디셔닝 배지는 공동 배양 시스템에 사용될 수 있으며, 여기서 간접 상호작용은 반응자 세포 유형1로 전달되는 이펙터 세포 유형의 컨디셔닝 배지에 포함된 분비된 분자에 의해 활성화됩니다.
측분비 세포 통신 연구의 경우, 간접 공동 배양 시스템은 생체 내에서 세포 상호 작용을 강력하게 반영하는 모델을 제공합니다. 간접 공동 배양 시스템이 개발되고 상용화되어 간접 공동 배양 모델 2,3의 확립이 가능해졌습니다. 안타깝게도 대부분의 간접 공동 배양 시스템은 두 개의 구획만 제공합니다. 다른 간접 공동 배양 시스템은 여러 구획을 제공하지만 현재 원고에 보고된 시스템에 비해 확장성이 떨어집니다. 그들 중 일부는 현미경으로 고전적인 시각화를 허용하지 않으며 종종 특정 응용 방법을 제시합니다. 여러 연구에서, 상이한 세포 유형 사이의 측분비 통신은 조건화 된 배지 모델 4,5,6,7에 의해 조사된다. 이것은 특정 방법이나 재료를 확립할 필요가 없기 때문에 간접 공동 배양 시스템에 비해 조사가 더 쉬운 방법입니다1. 반면에, 컨디셔닝 배지의 준비는 시간이 많이 걸리고 단방향 세포 신호전달(이펙터에서 반응자로)에 대한 정보만 제공합니다1.
이 논문에서는 세포 통신을 조사하는 새롭고 간단한 방법을 제안합니다. 직접 또는 간접 상호 작용과 2D 또는 3D 형식에서 여러 세포 유형을 결합할 수 있는 인쇄된 인서트는 공동 배양 모델을 쉽게 설정할 수 있는 많은 이점을 제공합니다. 6웰 플레이트의 웰에 배치되도록 조정된 3D 프린팅 인서트는 원형이며 웰을 4개의 구획(2개의 큰 구획과 2개의 작은 구획)으로 분리할 수 있습니다. 그림 1A). 3D 프린팅 인서트는 바닥이 없는 것이 특징입니다. 따라서, 셀은 인서트가 놓인 플레이트와 직접 접촉한다. 또한, 각 구획은 다른 구획과 독립적으로 코팅될 수 있다. 또한, 세포 거동은 광학 현미경으로 쉽게 추적할 수 있습니다. 인서트의 각 벽에 통신 창이 있으면 최적의 시간에 공통 배지를 추가하여 서로 다른 공동 배양 실험을 수행할 수 있습니다. 여러 세포 유형 간의 직접 및/또는 간접 통신을 연구하기 위해 공동 배양의 수많은 조합을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 단층 및/또는 3D(스페로이드)에서 4개의 서로 다른 세포 유형 간의 간접 공동 배양 모델을 설계할 수 있습니다. 직접 및 간접 공동 배양 모델의 조합은 동일한 구획에서 서로 다른 세포 유형을 혼합하여 수행할 수도 있습니다. 복잡한 구조(오가노이드, 조직 외식편 등)가 다양한 세포 유형에 미치는 영향은 만들 수 있는 모델의 또 다른 예가 될 수 있습니다. 또한 3D 프린팅 인서트는 세포 생물학 기능 분석(증식, 이동, 유사관 형성, 분화 등) 및 생화학 검사(DNA, RNA, 단백질, 지질 추출 등)와 호환됩니다. 마지막으로, 3D 프린팅 인서트는 서로 다른 구획에서 동일한 실험에서 서로 다른 분석을 동시에 결합할 수 있는 가능성과 함께 공동 배양 모델의 광범위한 실험 계획을 제공합니다.
3D 프린팅된 인서트의 일부 용량은 빠르고 사용하기 쉬운 공동 배양 모델임을 검증하기 위해 제공됩니다. 측분비 세포 통신에 대해 수행된 이전에 발표된 연구와 비교하여 3D 프린팅 삽입물이 가치 있는 공동 배양 모델이 될 수 있는 능력이 입증되었습니다. 이 점을 평가하기 위해 각질 세포에 의한 내피 세포 증식 및 이동 조절을 3D 프린팅 삽입 시스템과 조건 매체를 사용하는 기존 시스템 간에 비교했습니다. 3D 프린팅 인서트는 컨디셔닝 미디어를 사용하는 기존 시스템과 비교하여 유사한 결과를 빠르게 얻을 수 있습니다. 실제로, 3D 프린팅된 인서트는 컨디셔닝된 배지를 생성할 필요 없이 양방향으로 세포 상호작용을 연구할 수 있는 강력한 모델을 제공하며, 동일한 실험에서 증식 및 이동 분석을 병렬로 수행할 수 있습니다.
결론적으로, 이 논문에서는 세포 통신을 연구하기 위한 새롭고 즉시 사용 가능한 모델을 제안합니다. 모든 부착 세포 유형과 호환되는 3D 프린팅 인서트를 사용하면 생체 내 조건에 더 가까워지는 것을 목표로 하는 다양한 공동 배양 조합을 수행할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Getinge</td>
			<td>APHP</td>
			<td>Solid cycle, 121 &#176;C for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomed Clear</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-BMCL-01</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture detergents&#160;</td>
			<td>Tounett</td>
			<td>A18590/0116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Proliferation Reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11,64,48,07,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slide</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EVE-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture-Insert 2 Well in &#956;-Dish 35 mm</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80206</td>
			<td>two-migration chambers device.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001</td>
			<td>Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated cell counter&#160;</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>NESCT-EVE-001E&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS XL Core</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1200</td>
			<td>10x of magnification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food silicon reagent and catalyst kit</td>
			<td>Artificina</td>
			<td>RTV 3428 A and B&#160;</td>
			<td>(10:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FORM 3B printer</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td>
			<td>Impression performed by 3D-Morphoz company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS )</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro Wound Healing Tool Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesenchymal stem cell medium&#160;</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>7501</td>
			<td>Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader SPECTRO star NANO</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>BMG LABTECH software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-40232</td>
			<td>Without Ca2+ / Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>EBT-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td>Incubation of KORS at 37 &#176;C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate Nunclon Delta Surface</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative 3d-printed insert designed to enable straightforward 2d and 3d cell cultures

서로 다른 세포 유형 간의 간접 통신에 대한 고전적인 분석에서는 조건화된 배지를 사용해야 합니다. 또한, 컨디셔닝 배지의 생산은 시간이 많이 걸리고 생리학적 및 병리학적 상태와는 거리가 멀다. 공동 배양의 몇 가지 모델이 상업적으로 이용 가능하지만 특정 분석으로 제한되며 대부분 두 가지 유형의 세포에 대한 것입니다. 
여기에는 수많은 기능 분석과 호환되는 3D 프린팅 인서트가 사용됩니다. 인서트를 사용하면 6웰 플레이트의 웰 하나를 4개의 구획으로 분리할 수 있습니다. 다양한 조합을 설정할 수 있습니다. 또한, 창문은 구획의 각 벽에 설계되어 모든 구획 간의 잠재적인 세포 간 통신이 부피 의존적 방식으로 배양 배지에서 가능합니다. 예를 들어, 측분비 세포 간 통신은 단층, 3D(스페로이드) 또는 이 둘을 결합하여 4가지 세포 유형 간에 연구할 수 있습니다. 또한 서로 다른 세포 유형의 혼합을 2D 또는 3D(오가노이드) 형식으로 동일한 구획에 시딩할 수 있습니다. 3D 프린팅된 인서트에 바닥이 없기 때문에 플레이트의 일반적인 배양 조건, 인서트가 포함된 플레이트의 코팅 가능, 광학 현미경으로 직접 시각화할 수 있습니다. 다중 구획은 서로 다른 세포 유형을 독립적으로 수집하거나 각 구획에서 RNA 또는 단백질 추출을 위해 서로 다른 시약을 사용할 수 있는 가능성을 제공합니다. 본 연구에서는 새로운 3D 프린팅 인서트를 공동 배양 시스템으로 사용하기 위한 상세한 방법론을 제공합니다. 이 유연하고 간단한 모델의 여러 기능을 입증하기 위해 이전에 발표된 세포 통신의 기능적 분석이 새로운 3D 프린팅 인서트에서 수행되었으며 재현 가능한 것으로 입증되었습니다. 3D 프린팅된 삽입물과 컨디셔닝된 배지를 사용한 기존 세포 배양은 유사한 결과를 가져왔습니다. 결론적으로, 3D 프린팅 인서트는 부착 세포 유형을 가진 수많은 공동 배양 모델에 적용할 수 있는 간단한 장치입니다.

본 연구에서는 컨디셔닝 배지를 사용하여 기존 방법에 필적하는 강력하고 신뢰할 수 있으며 중요한 데이터를 얻기 위해 최적화된 공동 배양 시스템에 대해 설명했습니다. 3D 프린팅된 인서트는 실험에서 업스트림의 컨디셔닝 배지의 어려움과 시간 소모적인 생산을 극복함으로써 상호 작용에서 다양한 세포 유형의 생체 내 미세 환경 조건을 모방합니다. 이전에 발표된 연구는 모낭에 존재?...

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An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

이 논문에서는 새로 설계된 3D 프린팅 인서트를 공동 배양 모델로 제시하고 내피 세포와 각질 세포 사이의 측분비 세포 간 통신 연구를 통해 검증합니다.

간단한 2D 및 3D 세포 배양이 가능하도록 설계된 혁신적인 3D 프린팅 인서트

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

이 프로토콜은 수많은 배양 연구를 조사하고 직접 세포 통신을 조사하는 새로운 도구를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이 새로운 장치는 배양 모델을 설정하는 데 상당한 시간을 절약하고 특정 코팅이 필요하거나 필요하지 않은 다양한 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 실제로 3D 프린팅 인서트의 4개 구획을 통해 다양한 세포 유형을 단층으로 배양하거나 동일한 방식으로 다양한 조합으로 3D로 배양할 수 있습니다.3D 프린팅 인서트는 내구성, 유연성, 확장성이 뛰어나며 면역학 또는 안드로제네시스와 같은 생리병리학 연구를 위한 실험 모델을 설계하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 제조업체의 지침에 따라 70% 에탄올 멸균 주걱을 사용하여 키트에 제공된 두 가지 구성 요소인 식품 실리콘 및 촉매를 10:1의 비율로 혼합합니다. 핀셋으로 실리콘 혼합물에 인서트를 도포하여 혼합물이 인서트의 하단 가장자리에 균일하게 분포되도록 합니다.삽입물을 6웰 플레이트의 웰에 넣고 삽입물이 플레이트와 밀접하게 접촉되도록 부드러운 압력을 가하여 세포 배양 배지의 누출을 방지합니다. 플레이트를 섭씨 37도에 두어 실리콘의 응고 과정을 1시간 동안 지지합니다. 응고 후, 삽입물로 플레이트를 70 % 에탄올 욕조에 30 분에서 1 시간 동안 담가 멸균한다.다음으로, 피펫팅으로 알코올을 버리고, 플레이트를 세포 배양 후드에서 밤새 건조시킨다. 외근초와 인간 진피 미세혈관 내피 세포의 각질세포를 배양하기 위해 플라스크에서 배지를 버리고 5밀리리터의 트립신을 첨가하여 세포를 분리합니다. 5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 외근초의 각질형성세포가 들어있는 플라스크를 5분 동안 놓고 인간 진피 미세혈관 내피세포가 들어 있는 플라스크를 실온에서 5분 동안 배양한다.15밀리리터의 멸균 원추형 튜브에 외근초의 각질형성세포가 포함된 트립신 용액을 5%FBS 및 성장인자로 보충된 중간엽 줄기세포 배지 5밀리리터와 혼합하고, 인간 진피 미세혈관 내피세포에 5%FBS 및 성장인자를 보충한 내피세포 배지 5밀리리터를 혼합합니다. 바깥쪽 뿌리초의 각질세포와 인간 진피 미세혈관 내피 세포 현탁액을 200 G에서 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버린 후, 세포를 각각의 배지 2 밀리리터에 재현 탁시킨다.10 마이크로리터의 세포 현탁액을 10 마이크로리터의 트리판 블루 염료와 혼합하고, 혼합물의 10 마이크로리터를 카운팅 슬라이드의 챔버에 첨가한다. 계수 슬라이드를 세포 계수 시스템에 삽입하고 세포 번호와 생존력을 감지합니다. 각 배지에서 밀리리터 당 50, 000 세포의 농도로 세포 현탁액을 제조 한 후, 800 마이크로 리터 내지 1 밀리리터의 세포 현탁액을 개별 대형 구획에 분배하고, 100 내지 150 마이크로 리터를 피펫으로 개별 소형 구획에 분배한다.5% FBS와 성장 인자를 보충한 중간엽 줄기 세포 배지의 각질세포와 내피 세포 배지의 인간 진피 미세혈관 내피 세포, 5% FBS와 작은 구획과 기타 큰 구획의 성장 인자를 참조하십시오. 세포 배양 접시를 5% 이산화탄소가 있는 섭씨 37도에 놓거나 일반적인 조건에서 세포 부착 및/또는 성숙을 허용합니다. 피펫을 사용하여 삽입물의 다른 구획의 배양 배지를 비웁니다.그런 다음 큰 구획에서 섭씨 37도의 따뜻한 PBS 1밀리리터, 작은 구획에서 200마이크로리터로 세포를 헹굽니다. 모든 세포 유형에 대해 호환되도록 선택된 공통 배지 3밀리리터를 추가합니다. 공배양물이 들어 있는 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 24 내지 48시간 동안 놓는다.세포 현탁액 계수를 위해 트립신을 이용하여 세포를 분리하고, 트립판 블루 염색법을 이용하여 생존율을 확인하였다. 형태를 관찰한 후, 배양 24 내지 48시간 후에 광학 현미경 하에서 실험 동안 상이한 구획의 세포 수를 계수한다. 먼저, 실험이 끝날 때 6웰 플레이트에서 인서트를 살짝 비틀어 제거한 다음, 인서트를 당겨 인서트에서 실리콘을 제거합니다.기존의 세포 배양 세제와 세척 물질로 삽입물을 세척하십시오. 그런 다음 오토클레이브에서 나중에 사용할 수 있도록 삽입물을 멸균하거나 70% 에탄올 욕조에 1시간 동안 담그십시오. 표현형과 세포 생존율을 비교했는데, 여기서 90%의 생존율은 6개의 웰 플레이트의 웰에서 관찰되었고, 91%는 외부 치근초의 각질세포에 대한 3D 프린팅 삽입물에서 관찰되었습니다.인간 진피 미세혈관 내피 세포의 생존율은 6웰 플레이트의 웰에서 85%인 반면, 3D 프린팅 삽입물에서는 86%였습니다. 3D 프린팅 삽입물에서 각질 세포와 내피 세포 사이의 간접 세포 통신은 삽입물에 각질 세포가 존재할 때 인간 진피 미세혈관 내피 세포의 증식이 대조군에 비해 24시간 후 1.5배, 48시간 후 3.1배 크게 증가했음을 입증했습니다. 그러나, 외근초 조건 배지의 각질형성세포는 24시간 후 1.5배, 48시간 후 2.1배 증가하여 인간 진피 미세혈관 내피세포 증식을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다.3D 프린팅된 인서트 공동 배양 모델을 테스트하여 각질세포가 인간 진피 미세혈관 내피 세포 이동에 미치는 영향을 확인했습니다. 대조군 조건에서 내피 세포는 이동하여 24시간 후 상처 부위의 약 44%를 덮었습니다. 각질 세포의 존재 하에서, 인간 피부 미세 혈관 내피 세포 이동의 현저한 증가가 관찰되었으며, 이는 상처 부위의 43 % 67 %와 99 %가 각각 3 시간, 12 시간 및 24 시간 후에 덮여있는 것을 보여준다.유사하게, HDMEC의 이동은 외부 치근초 상태 배지의 각질세포의 존재 하에서 증가합니다. 한 구획에서 다른 구획으로 세포 매체가 누출되는 것을 방지하기 위해 플레이트에 인서트를 밀봉하는 것이 중요합니다. 증식, 이동, 진정 형성 분석 DNA, RNA, 단백질 및 기타 분석과 같은 여러 응용 분야가 이루어질 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

자기편 셀룰러 문화에 대한 산소 삽입 제작 및 운영

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

연구

생물학

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

세포 외 산 성 pH 문화 체계의 설립

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

범블 비(봄푸스)하이브 입구를위한 3D 인쇄 꽃가루 트랩

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

도립 현미경을 사용하여 피부 세포 역학을 추적하는 생체 내 이미징

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

저자 스포트라이트: In Vivo Intravital Imaging을 위한 도립 컨포칼 현미경 사용 도구 개발 

도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...