Användning av expansionsmikroskopi för att fysiskt förstora hela Drosophila-embryon för superupplösningsavbildning

Detta protokoll kan implementeras i de flesta laboratorier för esofagus utvecklingsbiologi, vilket gör det möjligt för forskare som inte har tillgång till superupplösningsmikroskop att producera superupplösta bilder. Den största fördelen med denna teknik är att den gör det möjligt för forskare att kringgå diffraktionsgränsen för konventionell konfokalmikroskopi utan att kräva ett superupplösningsmikroskop genom att expandera själva provet. Detta protokoll kommer att vara till nytta för dem som studerar hur proteinlokalisering påverkar cellmorfologi eller funktion i intakta embryon, särskilt när dessa proteiner är organiserade i komplexa subcellulära strukturer eller nätverk.

Det vanligaste problemet som människor stöter på är att förlora embryon under hela protokollet. Det är tillrådligt att applicera flera lager Poly-L-lysin för att fästa embryona ordentligt. Efter embryona tar du en sex centimeter lång petriskål i plast fylld till hälften med 3 % agar.

Gör en rektangel på fem gånger tre centimeter i agarn med ett rakblad eller en skalpell. Ta bort agarplattan med en liten labbspatel. Vänd sedan upp och ner på petriskålens botten, ställ den på bänken och placera agarplattan ovanpå den uppochnedvända skålen.

Ta av locket från petriskålen och se till att den är torr. Använd handskar och fäst en bit dubbelhäftande tejp på insidan av locket. Ta ut injektionsflaskorna med de dragerade och fixerade embryona ur skakapparaten och placera dem vertikalt på arbetsbänken.

Låt de organiska och vattenhaltiga faserna separeras. Korrekt fixerade embryon bör stanna kvar vid sitt gränssnitt. Ta bort den nedre vattenfasen helt med en Pasteur-pipett och en P200-pipett.

Använd en Pasteur-pipett av glas utrustad med en latexbulb för att överföra de fasta embryona till en agarplatta i flera små satser så att de inte fastnar på insidan av pipetten. När embryona är på agarplattan, använd en P200-pipetter för att ta bort eventuell kvarvarande heptan nära embryona. Släpp nu det dubbelsidiga tejplocket på agarplattan från en höjd av två centimeter för att fästa embryona på tejpen.

Ta försiktigt bort locket från agarplattan, placera den upp och ner på bänken och tillsätt tillräckligt med PBS Tween för att täcka embryona i locket. För att samla in de önskade embryona, använd ett stereodissektionsmikroskop med 100x förstoring med indirekt belysning. Stick vitellinmembranet nära den främre eller bakre änden av embryot med en fin glasnål för att tömma det på luft och släppa trycket.

Använd en fin pincett eller en metallsond för att försiktigt trycka ut embryot genom hålet med vitellinmembranet fortfarande fäst vid den dubbelhäftande tejpen. Lämna oönskade embryon på tejpen. Använd regelbundet en Pasteur-pipett av glas för att samla upp eventuella flytande devitelliniserade embryon och flytta dem till ett 1,5 milliliters mikrofugerör.

Bered PDMS-lösningen i ett 50 ml koniskt rör och skapa ett balanserat rör genom att tillsätta en lämplig mängd vatten till ett andra 50 ml koniskt rör. Centrifugera PDMS-lösningen vid 500 G i tre minuter vid 15 grader Celsius. Häll den sedan i en 10 centimeter stor petriskål till ett djup av en millimeter.

Låt PDMS-lösningen stelna över natten vid 55 grader Celsius. När PDMS-plattan har stelnat, skär kvadratiska ytor något mindre än en 22 x 22 millimeter täckglas med hjälp av en skalpell. Inuti varje ruta, skåra och ta bort en åtta millimeter bred fyrkantsbrunn.

överför varje fyrkantig PDMS-brunn till ett 22 x 22 millimeter täckglas och fäst det ordentligt. För att fästa embryona på täckglasen, applicera tillräckligt med 0,1 % poly-L-lysin för att täcka täckglasets yta inuti varje brunn och placera dem i en inkubator för 55 grader Celsius för att torka. Skölj embryona och PBS kort för att ta bort interpoleringstvättmedlet.

Överför sedan mer än 10 embryon till varje poly-L-lysinbelagd brunn. Låt embryona sjunka till botten av brunnarna. Ta bort överflödig vätska från de vidhäftade embryona med hjälp av en Pasteur-pipett och fortsätt omedelbart till nästa steg.

Medan embryona sitter i monomerlösningen, förbered en gelningslösning för att täcka PDMS-brunnarna. Späd ut den katalytiska oxidanten färskt från pulvret. Kombinera 3 920 mikroliter monomerlösning med 60 mikroliter 10% TEMED och 20 mikroliter 1% TEMPO.

Dela upp geleringslösningen i 125 mikroliters alikvoter i flera PCR-rör. Ta bort monomerlösningen från PDMS-brunnarna med hjälp av vakuum eller pipetter och var noga med att inte störa embryona. Tillsätt fem mikroliter APS till ett av PCR-rören som innehåller geleringslösning för att initiera polymerisation.

Fördela snabbt den polymeriserande geleringslösningen mellan de tre brunnarna. Upprepa detta tills alla brunnar och embryon är täckta. Låt proverna gela i 1,5 till 2,5 timmar vid 37 grader Celsius.

Tjockare hydrogeler tar längre tid att slutföra polymerisationen och stelna. Rör om hydrogelerna ofta för att övervaka polymerisationen. När hydrogelerna väl har stelnat kommer de inte att vicka.

Efter gelning, skala PDMS-brunnarna från täckglaset utan att störa hydrogelerna. Överför hydrogelerna individuellt till brunnarna på en platta med sex brunnar. Hydrogelerna kan expandera något under matsmältningen.

Täck gelerna helt med matsmältningsbuffert. 30 milliliter rötningsbuffert räcker för att täcka dem i en platta med sex brunnar och inkubera dem i en timme vid 37 grader Celsius. Efter matsmältningen, flytta hydrogelerna till en sex centimeter petriskål och fyll den med avjoniserat vatten för att expandera.

Hydrogelerna kan lossna från täckglasen vid denna tidpunkt och expandera fyra gånger i linjär dimension. Använd en Pasteur-pipett och ta bort så mycket överflödigt vatten från petriskålen som möjligt för att minimera gelernas rörelse när du hanterar den. Manövrera de expanderade gelerna med embryona på undersidan på en stor täckglas för avbildning.

Montera varje täckglas med gel över objektivet på ett inverterat laserskanningskonfokalmikroskop. Efter att ha lokaliserat de korrekt iscensatta och orienterade proverna bytte de till ett högförstoringsolje- eller vattennedsänkningsobjektiv för att ta bilder med hög upplösning. Mätning av embryolängd längs huvud-svans-axeln under ett 10x-objektiv visade att oexpanderade embryon sträckte sig över ungefär ett halvt synfält, medan de expanderade embryona sträckte sig över ungefär två hela synfält.

Den genomsnittliga längden från huvud till svans på de oexpanderade kontrollembryona var 398,8 mikrometer. För experiment ett, två och tre var den genomsnittliga embryolängden expansionsfaktorer på 4,0 gånger, 4,7 gånger respektive 4,9 gånger. I kontrollprovet hade cellerna i maxillärsegmentet en genomsnittlig bredd på 4,76 mikrometer.

I de expanderade proverna hade cellerna i maxillärsegmentet en genomsnittlig bredd på 19,10 mikrometer, vilket motsvarar en 4,0-faldig expansion. Cytoskelettet aktomyosin avbildades i oexpanderad kontroll jämfört med expanderade embryon, som genomgick konvergent förlängning. De framträdde som en enda linje där angränsande celler möttes.

I embryon i det sjunde stadiet kunde parallella linjer av myosin två däremot observeras vid cellkorsningar, vilket representerar kortikala proteinpooler i intilliggande celler. I de oexpanderade embryona i stadium sex uppträdde mitokondrierna märkta med streptavidin som en heterogen cytoplasmatisk dimma utan några tydliga subcellulära detaljer. Men i de expanderade embryona kunde många puncta lösas upp i cytoplasman, vilket sannolikt representerade fragmenterade mitokondrier eller delar av det mitokondriella nätverket.

En viktig sak att komma ihåg när man försöker sig på denna procedur är att skydda embryona från överdriven ljusexponering efter den sekundära antikroppsinkubationen.