Name: the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach at JoVE.com

Forskningen præsenteret i denne artikel blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 til CBL.

Alle zebrafiskembryoner, der anvendes i denne procedure, blev opdrættet og opdrættet i henhold til etablerede IACUC-protokoller12. Disse protokoller blev godkendt af University of Louisville.
BEMÆRK: Den vilde zebrafiskstamme, AB, og bmp4st72;smad5b1100 dobbeltmutantlinjen blev anvendt i denne undersøgelse. Alt det vand, der blev brugt i denne procedure, var sterilt omvendt osmosevand. Konfokale billeder blev taget under et laserscanni...

<ol>
	<li>Denny, L., Coles, S., Blitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+syndrome+and+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders.</a> American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).</li><li>Popova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comorbidity+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).</li><li>Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+spectrum+disorders:+Characteristics,+complications,+and+treatment.">Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment.</a> Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).</li><li>Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+presentation,+diagnosis,+and+management+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder.</a> The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).</li><li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors.">A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).</li><li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+gene-alcohol+interactions.">Animal models of gene-alcohol interactions.</a> Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).</li><li>Fernandes, Y., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Genesis. 59 (11), 23460 (2021).</li><li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis:+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li><li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research.">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+forTol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tol2+gateway-compatible+toolbox+for+the+study+of+the+nervous+system+and+neurodegenerative+disease.">A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease.</a> Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Protocols. UMass Chan Medical School Available from: <a target="_blank" href="https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols">https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols</a> (2017)</li><li>Mosimann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+gateway+calculations:+Excel+spreadsheet.">Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet.</a> protocols.io. , (2022).</li><li>Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-endodermal+interactions+are+required+for+pancreatic+&#946;+cell+induction.">Intra-endodermal interactions are required for pancreatic &#946; cell induction.</a> Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).</li><li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish.">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li><li>Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+(Danio+rerio)+as+an+emerging+model+system+in+ecotoxicology+and+toxicology:+Historical+review,+recent+advances,+and+trends.">Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends.</a> Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).</li><li>Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+the+toxicant+screening+model:+Transgenic+and+omics+approaches.">Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches.</a> Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).</li><li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li><li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+transgenesis,+gene+trapping,+enhancer+trapping,+and+Gal4-UAS+system.">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li></ol>

Zebrafisk er ideelle til at studere virkningen af ethanoleksponering på udvikling og sygdomstilstande 7,8. Zebrafisk producerer et stort antal gennemsigtige, eksternt befrugtede, genetisk medgørlige embryoner, hvilket muliggør levende billeddannelse af flere transgenmærkede væv og celletyper samtidigt i flere miljøsammenhænge19,20. Disse styrker kombineret med den stærke udviklingsmæssige genetis...

Prænatal ethanoleksponering giver anledning til et kontinuum af strukturelle underskud og kognitive svækkelser kaldet føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD)1,2,3,4. De komplekse forhold mellem flere faktorer gør det udfordrende at studere og forstå ætiologien af FASD hos mennesker. For at løse denne udfordring er der anvendt en lang række dyremodeller. De biologiske og eksperimentelle værktøjer, der er tilgængelige i disse modeller, har vist sig afgørende for at udvikle vores forståelse af det mekanistiske grundlag for ethanolteratogenicitet, og resultaterne fra disse modelsystemer har været bemærkelsesværdigt konsistente med, hvad der findes i humane ethanolstudier 5,6. Blandt disse har zebrafisk vist sig som en stærk model til at studere ethanol teratogenese7,8, dels på grund af deres ydre befrugtning, høj frugtbarhed, genetisk trækbarhed og gennemskinnelige embryoner. Disse styrker kombineres for at gøre zebrafisk ideel til realtids live imaging undersøgelser af FASD ved hjælp af transgene zebrafisklinjer.
Transgene zebrafisk er blevet flittigt brugt til at studere flere aspekter af embryonal udvikling9. Imidlertid kan det være yderst vanskeligt at skabe transgene konstruktioner og efterfølgende transgene linjer. Et standardtransgen kræver et aktivt promotorelement til at drive transgenet og et poly A-signal eller "hale", alt sammen i en stabil bakterievektor til generel vektorvedligeholdelse. Den traditionelle generation af en transgen multikomponent konstruktion kræver flere tidskrævende underkloningstrin10. PCR-baserede tilgange, såsom Gibson-samling, kan omgå nogle af de problemer, der er forbundet med underkloning. Imidlertid skal unikke primere designes og testes til generering af enhver unik transgen konstruktion10. Ud over transgenkonstruktion har genomisk integration, kimlinjeoverførsel og screening for korrekt transgenintegration også været vanskelig. Her beskriver vi en protokol til brug af det transposonbaserede Tol2-transgenesesystem (Tol2Kit)10,11. Dette modulære system bruger multisite Gateway-kloning til hurtigt at generere flere transgene konstruktioner fra et stadigt voksende bibliotek med "entry" og "destination" vektorer. Integrerede Tol2 transponerbare elementer øger transgenesehastigheden kraftigt, hvilket muliggør hurtig konstruktion og genomisk integration af flere transgener. Ved hjælp af dette system viser vi, hvordan dannelsen af en endoderm transgen zebrafiskelinje kan bruges til at studere de vævsspecifikke strukturelle defekter, der ligger til grund for FASD. I sidste ende viser vi i denne protokol, at den modulære opsætning og konstruktionen af transgene konstruktioner i høj grad vil hjælpe zebrafiskbaseret FASD-forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene Tol2 toolbox</td>
			<td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided directly by the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>2486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Dissecting Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lawsone Lab Donor Plasmid Prep</td>
			<td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II Plus Enzyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12538200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipette holder</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MIMPH-M-PIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 0.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet</td>
			<td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4758-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup .22 &#181;m vacuum filtration system&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU11RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2 Wiki Page</td>
			<td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipetter Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>i34</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach

Føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) er kendetegnet ved et meget variabelt sæt strukturelle defekter og kognitive svækkelser, der opstår på grund af prænatal ethanoleksponering. På grund af FASD's komplekse patologi har dyremodeller vist sig at være afgørende for vores nuværende forståelse af ethanol-inducerede udviklingsfejl. Zebrafisk har vist sig at være en stærk model til at undersøge ethanol-inducerede udviklingsfejl på grund af den høje grad af bevarelse af både genetik og udvikling mellem zebrafisk og mennesker. Som modelsystem besidder zebrafisk mange egenskaber, der gør dem ideelle til udviklingsstudier, herunder et stort antal eksternt befrugtede embryoner, der er genetisk medgørlige og gennemskinnelige. Dette giver forskere mulighed for præcist at kontrollere timingen og doseringen af ethanoleksponering i flere genetiske sammenhænge. Et vigtigt genetisk værktøj, der er tilgængeligt i zebrafisk, er transgenese. Imidlertid kan generering af transgene konstruktioner og etablering af transgene linjer være kompleks og vanskelig. For at løse dette problem har zebrafiskforskere etableret det transposonbaserede Tol2-transgenesesystem. Dette modulære system bruger en multisite Gateway-kloningsmetode til hurtig samling af komplette Tol2-transposonbaserede transgene konstruktioner. Her beskriver vi den fleksible Tol2-systemværktøjskasse og en protokol til generering af transgene konstruktioner, der er klar til zebrafisktransgenese og deres anvendelse i ethanolstudier.

For at generere de transgene konstruktioner brugte vi Tol2-transgenesesystemet. Tre indgangsvektorer, herunder p5E, som indeholder genpromotor/forstærkerelementerne, pME, som holder genet, der skal udtrykkes af promotor/forstærkerelementerne, og p3E, som mindst holder polyA-halen, blev brugt til at generere den transgene konstruktion via multisite gateway LR-kloning. Destinationsvektoren, pDest, giver Tol2-gentagelserne til genomisk indsættelse af den transgene konstruktion i zebrafiskembryoner og indeholder ...

Watch this Scientific Journal Video about The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach at JoVE.com

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Dette arbejde beskriver en protokol for det modulære Tol2 transgenesesystem, en gateway-baseret kloningsmetode til at skabe og injicere transgene konstruktioner i zebrafiskembryoner.

Zebrafish Tol2-systemet: En modulær og fleksibel gateway-baseret transgenesetilgang

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Transgene zebrafisk har vist sig at være afgørende for vores forståelse af embryoudvikling. Tol2-systemet er et alsidigt værktøj, der gør det muligt for forskere hurtigt og systematisk at generere flere transgene zebrafisk til FASD-undersøgelser. Det modulære design og letheden ved at generere nye kitkomponenter gør Tol2-systemet til et alsidigt værktøj til generering af nye transgene stoffer uden at skulle redesigne nogen komponenter i sættet.Mit råd til forskere, der udfører denne teknik for første gang, er at lave flere prøvekørsler for at træne præcisionen ved at generere og injicere transgene konstruktioner. Til at begynde med lineariseres Tol2-kitplasmidet indeholdende transposase med en nought en-restriktionsendonuklease ved at kombinere 10 mikroliter transposaseplasmid, 1,5 mikroliter restriktionsendonukleasereaktionsbuffer og 0,3 mikroliter nought en endonuklease i et 500 mikroliter mikrocentrifugerør. Fyld reaktionen op til 20 mikroliter med RNAse-frit vand.Bland og fordøje ved 37 grader Celsius natten over. Den næste dag skal du stoppe fordøjelsen ved at tilsætte en mikroliter 0,5 molær EDTA, to mikroliter fem molært ammoniumacetat og 80 mikroliter 100% ethanol til reaktionsblandingen. Bland og afkøl ved minus 20 grader Celsius natten over.Den følgende dag centrifugeres og aspireres supernatanten, inden DNA-pillen resuspenderes i RNAse-frit vand. Derefter bestemmes den lineære plasmidkoncentration i nanogram pr. Mikroliter på et fluorometer ved at køre to mikroliter af prøven. Opsæt SP6 mRNA-produktionen ved at kombinere 10 mikroliter 2X NTP / CAP, to mikroliter 10X reaktionsbuffer, 0,1 til et mikrogram lineær DNA-skabelon i to mikroliter SP6-enzymblanding i et 500 mikroliter rør.Fyld reaktionen op til 20 mikroliter med RNAse-frit vand og bland inden inkubation ved 37 grader Celsius. Efter to timer tilsættes en mikroliter DNAse, blandes godt og inkuberes i yderligere 15 minutter. Stop reaktionen ved at tilsætte 30 mikroliter lithiumchloridudfældningsopløsning.Bland og afkøl ved minus 20 grader Celsius natten over. Næste dag centrifugeres opløsningen for at pelletere mRNA'et og aspirere supernatanten, inden pelleten vaskes med en milliliter 80% ethanol. Lufttør pillen og resuspender den i 20 mikroliter RNAse-frit vand.Bestem mRNA-koncentrationen ved hjælp af et fluorometer, alikvote derefter 100 nanogram mRNA pr. Rør til engangsbrug og opbevar ved minus 80 grader Celsius. For at udføre reaktionen skal du samle 10 femtomol hver af P5E, PME og P3E og 20 femtomol af destinationsvektoren PDEST. Identificer størrelsen af alle fire vektorer og basepar fra plasmidkilden.Efter bestemmelse af koncentrationen af alle fire vektorer ved anvendelse af DNA-vægten som 660 gram pr. mol og plasmidstørrelse og basepar beregnes de samlede nanogram plasmid, der er nødvendige for at nå enten 10 femtomol for indgangsvektorer eller 20 femtomol for destinationsvektor. Generer derefter konstruktionen sox17:EGFP-CAAX ved hjælp af de komponenter, der er beskrevet i manuskriptet. Brug plasmidkoncentrationen til at beregne de samlede mikroliter af hvert plasmid, der er nødvendigt for at nå enten 10 femtomol eller 20 femtomol, og divider derefter dette med to til brug i de fem mikroliter halv LR-reaktioner.Generer 10 femtomol P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly (A) og 20 femtomol destinationsvektor. Opsæt fem mikroliter halv LR-reaktion ved at kombinere volumenerne af P5E, PME, P3E og PDEST i et 500 mikroliter rør. Tilsæt derefter sterilt vand for at gøre volumenet fire mikroliter.Vortex LR-enzymblandingen to gange i et minut hver, før der tilsættes en mikroliter til reaktionen, og blandes grundigt, før den inkuberes ved 25 grader Celsius. Den følgende dag skal du stoppe LR-reaktionen ved at tilsætte 0,5 mikroliter proteinase K.Inkubat ved 37 grader Celsius i 10 minutter og derefter afkøle til stuetemperatur. Derefter omdannes tre til fire mikroliter plasmidet til optøede kemisk kompetente celler ved at tilsætte plasmidet og lade cellerne sidde på is i 25 til 30 minutter.Derefter varmechok cellerne i et 42 grader Celsius vandbad i 30 sekunder. Efter varmechokket tilsættes 250 mikroliter antibiotikafri rige flydende medier til cellerne og inkuberes med omrystning ved 37 grader Celsius i 1,5 timer. Spred 300 mikroliter bakteriel suspension på en ampicillin Luria-Bertani plade og inkuber natten over.Den følgende dag screenes kolonierne for tilstedeværelsen af to fænotyper:klar og uigennemsigtig. Vælg de klare kolonier en ad gangen, pod den flydende kultur og ryst ved 37 grader Celsius natten over. Kombiner 150 nanogram plasmid, 100 nanogram transposase mRNA og 2% phenolrød på is.Tilsæt derefter RNA-frit vand for at gøre volumenet tre mikroliter. Overfør et cellestadieembryo ved hjælp af overførselspipetter til injektionspladen fyldt med EM, der dækker agaren fuldstændigt, og tryk derefter forsigtigt ca. 50 til 75 embryoner pr. sprække på injektionspladen. Tilsæt mRNA-plasmidet phenolrød blanding til den åbne ende af en kapillær injektionsnål.Placer kapillærnålen i injektionsriglens anker, og tænd injektionsriggen. Sænk nålen ned i injektionspladen, og knæk spidsen med pincet, så kun en lille mængde blanding pumpes ud af injektionsriggen. Injicer embryonerne med en tre nanoliter bolus af mRNA-plasmidet phenolrød blanding i embryoets cellelegeme.Når du er færdig, fjernes embryonerne fra injektionspladen ved forsigtigt at poppe dem ud af spalten og overføre pipetten til en 100 millimeter petriskål med frisk EM. Inkuber ved 28,5 grader Celsius. Vælg det passende udviklingstrin til fluorescerende transgenekspression og skærm under et fluorescerende dissekeringsmikroskop. Screening for ikke-fluorescerende transgener ved screening for fluorescerende transgene markører såsom GFP drevet af den hjertespecifikke promotor for genet Cmlc2.Når de embryoner, der er positive for transgen indsættelse, udvikler sig til voksne og når ynglealderen, screenes de individuelt for kimlinjeoverførsel og transgenekspressivitet ved at opdrætte dem til vildtype zebrafisk. Eksempler på bakteriekolonier opnået ved transformation af LR-rekombinationen vises. Klare kolonier indeholdt et korrekt LR-rekombinationsprodukt mere end 85% af tiden, mens uigennemsigtige kolonier aldrig indeholdt et korrekt rekombinationsprodukt.Diagnostisk fordøjelse af de tre kolonier fra transformationen af LR-rekombinationsprodukterne viste, at den enkelte uigennemsigtige koloni ikke indeholdt noget plasmid, mens de to klare kolonier indeholdt et enkelt bånd ved 9.544 basepar. Transposase mRNA ved 1.950 basepar er vist her. Mosaisk endoderm EGFP-CAAX-ekspression blev observeret i 75% af de injicerede embryoner.Transgen markørekspression af Cmlc2 EGFP i det udviklende hjerte blev observeret 24 timer efter befrugtning. Voksne zebrafisk havde kimlinjeoverførsel af sox17: EGFP-CAAX genererede fluorescerende embryoner med endoderm fuldt mærket med EGFP-CAAX. Både den forreste og bageste længde af endodermen og den dorsal-ventrale længde af hver pose fra poser et til fem blev målt i kontrol- og ethanolbehandlede vildtype BMP-mutantembryoner.Den samlede længde af endoderm blev ikke påvirket af genotype eller behandling. Imidlertid viste pose et og tre signifikante stigninger i poselængden mellem ubehandlede og ethanolbehandlede vildtypeembryoner, men signifikante fald i længden mellem ubehandlede og ethanolbehandlede BMP-mutanter. Pose to viste signifikante stigninger i posestørrelse mellem henholdsvis de ubehandlede og ethanolbehandlede vildtype- og BMP-mutantgrupper.Når du forsøger denne procedure, er det afgørende at være præcis i pipettering og fortynding af Tol2-systemet, samt at ramme cellekroppen under embryoinjektion.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Live-Imaging af medfødte immunsystem og præneoplastiske celleinteraktioner Brug en inducerbar Gal4 / UAS Expression System i Larve Zebrafisk Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic fremgangsmåde for vurdering af Dannelse af neuronal forbindelser i en co-kultur System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Mosaic zebrafisk Transgenese for Funktionel Genomisk analyse af kandidatlandenes Cooperative gener i Tumor Patogenese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Anvendelse af Teton System til Undersøgelse molekylære mekanismer for zebrafisk Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginat Indkapsling af pluripotente stamceller Ved hjælp af en Co-aksial dyse

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Mikroperle Implantation i Zebrafisk Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Sporing Celler i GFP-transgene zebrafisk Brug af Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Mikroinjektion for Transgenese og Genome Redigering i Trepigget Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Præcis Cellular Ablation Approach for modellering af akut nyreskade i udviklingen af ​​zebrafisk

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...