Name: the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00
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La recherche présentée dans cet article a été soutenue par une subvention des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 à CBL.

Tous les embryons de poisson zèbre utilisés dans cette procédure ont été élevés et élevés conformément aux protocoles IACUCétablis 12. Ces protocoles ont été approuvés par l’Université de Louisville.
NOTE: La souche de poisson-zèbre de type sauvage, AB, et la lignée double mutante bmp4st72;smad5b1100 ont été utilisées dans cette étude. Toute l’eau utilisée dans cette procédure était de l’eau stérile par osmos...

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V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li><li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+transgenesis,+gene+trapping,+enhancer+trapping,+and+Gal4-UAS+system.">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li></ol>

Le poisson zèbre est idéal pour étudier l’impact de l’exposition à l’éthanol sur le développement et les états pathologiques 7,8. Le poisson zèbre produit un grand nombre d’embryons translucides, fécondés à l’extérieur et génétiquement traitables, ce qui permet l’imagerie en direct de plusieurs tissus et types de cellules marqués par des transgènes simultanément dans de multiples contextes environnementaux19,20...

L’exposition prénatale à l’éthanol donne lieu à un continuum de déficits structurels et de déficiences cognitives appelés troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF)1,2,3,4. Les relations complexes entre de multiples facteurs rendent difficile l’étude et la compréhension de l’étiologie de l’ETCAF chez les humains. Pour résoudre ce problème, une grande variété de modèles animaux ont été utilisés. Les outils biologiques et expérimentaux disponibles dans ces modèles se sont avérés cruciaux pour développer notre compréhension de la base mécaniste de la tératogénicité de l’éthanol, et les résultats de ces systèmes modèles ont été remarquablement cohérents avec ce que l’on trouve dans les études sur l’éthanol humain 5,6. Parmi ceux-ci, le poisson zèbre est apparu comme un modèle puissant pour étudier la tératogenèse de l’éthanol 7,8, en partie en raison de leur fécondation externe, de leur fécondité élevée, de leur traçabilité génétique et de leurs embryons translucides. Ces forces se combinent pour rendre le poisson zèbre idéal pour les études d’imagerie en temps réel de l’ETCAF à l’aide de lignées de poissons-zèbres transgéniques.
Le poisson-zèbre transgénique a été largement utilisé pour étudier de multiples aspects du développement embryonnaire9. Cependant, la création de constructions transgéniques et de lignées transgéniques ultérieures peut être extrêmement difficile. Un transgène standard nécessite un élément promoteur actif pour piloter le transgène et un signal poly A ou « queue », le tout dans un vecteur bactérien stable pour le maintien général du vecteur. La génération traditionnelle d’une construction transgénique à plusieurs composants nécessite plusieurs étapes de sous-clonagechronophages 10. Les approches basées sur la PCR, telles que l’assemblage Gibson, peuvent contourner certains des problèmes associés au sous-clonage. Cependant, des amorces uniques doivent être conçues et testées pour la génération de chaque construction transgénique unique10. Au-delà de la construction transgénique, l’intégration génomique, la transmission germinale et le criblage d’une intégration correcte des transgènes ont également été difficiles. Ici, nous décrivons un protocole d’utilisation du système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons (Tol2Kit)10,11. Ce système modulaire utilise le clonage de passerelle multisite pour générer rapidement plusieurs constructions transgéniques à partir d’une bibliothèque en constante expansion de vecteurs « d’entrée » et de « destination ». Les éléments transposables Tol2 intégrés augmentent considérablement le taux de transgénèse, permettant la construction rapide et l’intégration génomique de plusieurs transgènes. À l’aide de ce système, nous montrons comment la génération d’une lignée de poisson-zèbre transgénique endodermique peut être utilisée pour étudier les défauts structurels spécifiques aux tissus sous-jacents à l’ETCAF. En fin de compte, dans ce protocole, nous montrons que la configuration modulaire et la construction de constructions transgéniques aideront grandement la recherche sur l’ETCAF à base de poisson zèbre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene Tol2 toolbox</td>
			<td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided directly by the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>2486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Dissecting Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lawsone Lab Donor Plasmid Prep</td>
			<td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II Plus Enzyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12538200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipette holder</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MIMPH-M-PIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 0.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet</td>
			<td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4758-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup .22 &#181;m vacuum filtration system&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU11RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2 Wiki Page</td>
			<td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipetter Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>i34</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach

Les troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF) sont caractérisés par un ensemble très variable de défauts structurels et de déficiences cognitives qui surviennent en raison de l’exposition prénatale à l’éthanol. En raison de la pathologie complexe de l’ETCAF, les modèles animaux se sont révélés essentiels à notre compréhension actuelle des défauts de développement induits par l’éthanol. Le poisson zèbre s’est avéré être un modèle puissant pour examiner les défauts de développement induits par l’éthanol en raison du degré élevé de conservation de la génétique et du développement entre le poisson zèbre et les humains. En tant que système modèle, le poisson zèbre possède de nombreux attributs qui le rendent idéal pour les études de développement, y compris un grand nombre d’embryons fécondés à l’extérieur qui sont génétiquement traitables et translucides. Cela permet aux chercheurs de contrôler avec précision le moment et le dosage de l’exposition à l’éthanol dans de multiples contextes génétiques. Un outil génétique important disponible chez le poisson zèbre est la transgénèse. Cependant, générer des constructions transgéniques et établir des lignées transgéniques peut être complexe et difficile. Pour résoudre ce problème, les chercheurs sur le poisson zèbre ont établi le système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons. Ce système modulaire utilise une approche de clonage de passerelle multisite pour l’assemblage rapide de constructions transgéniques complètes basées sur des transposons Tol2. Ici, nous décrivons la boîte à outils flexible du système Tol2 et un protocole pour générer des constructions transgéniques prêtes pour la transgénèse du poisson zèbre et leur utilisation dans les études sur l’éthanol.

Pour générer les constructions transgéniques, nous avons utilisé le système de transgénèse Tol2. Trois vecteurs d’entrée, dont p5E, qui contient les éléments promoteur/amplificateur de gène, pME, qui contient le gène à exprimer par les éléments promoteurs/amplificateurs, et p3E qui, au minimum, détient la queue polyA, ont été utilisés pour générer la construction transgénique via le clonage LR de passerelle multisite. Le vecteur de destination, pDest, fournit les répétitions Tol2 pour l...

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The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Le poisson zèbre transgénique s’est avéré essentiel à notre compréhension du développement embryonnaire. Le système Tol2 est un outil polyvalent qui permet aux chercheurs de générer rapidement et systématiquement plusieurs poissons-zèbres transgéniques pour les études sur l’ETCAF. La conception modulaire et la facilité de génération de nouveaux composants du kit font du système Tol2 un outil polyvalent pour générer de nouveaux transgéniques sans avoir à redessiner les composants du kit.Mon conseil aux chercheurs qui pratiquent cette technique pour la première fois est de faire plusieurs essais pour s’entraîner à la précision de la génération et de l’injection de constructions transgéniques. Pour commencer, linéariser le plasmide du kit Tol2 contenant de la transposase avec une endonucléase de restriction nulle en combinant 10 microlitres de plasmide transposase, 1,5 microlitre de tampon de réaction de l’endonucléase de restriction et 0,3 microlitre d’endonucléase nulle dans un tube microcentrifuge de 500 microlitres. Remplissez la réaction jusqu’à 20 microlitres avec de l’eau sans ARNase.Mélanger et digérer à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, arrêtez la digestion en ajoutant un microlitre d’EDTA 0,5 molaire, deux microlitres d’acétate d’ammonium molaire et 80 microlitres d’éthanol à 100% au mélange réactionnel. Mélanger et refroidir à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, centrifuger et aspirer le surnageant avant de remettre en suspension la pastille d’ADN dans de l’eau aRNASE. Ensuite, déterminez la concentration plasmidique linéaire en nanogrammes par microlitre sur un fluoromètre en faisant couler deux microlitres de l’échantillon. Configurez la production d’ARNm SP6 en combinant 10 microlitres de NTP / CAP 2X, deux microlitres de tampon de réaction 10X, 0,1 à un microgramme de matrice d’ADN linéaire dans deux microlitres de mélange d’enzymes SP6 dans un tube de 500 microlitres.Remplissez la réaction jusqu’à 20 microlitres avec de l’eau sans ARNase et mélangez avant d’incuber à 37 degrés Celsius. Après deux heures, ajoutez un microlitre d’ADNASE, mélangez bien et incuber pendant 15 minutes supplémentaires. Arrêtez la réaction en ajoutant 30 microlitres de solution de précipitation de chlorure de lithium.Mélanger et refroidir à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, centrifuger la solution pour granuler l’ARNm et aspirer le surnageant avant de laver la pastille avec un millilitre d’éthanol à 80%. Sécher la pastille à l’air libre et la remettre en suspension dans 20 microlitres d’eau sans ARNase.Déterminer la concentration d’ARNm à l’aide d’un fluoromètre, puis aliquote 100 nanogrammes d’ARNm par tube à usage unique et stocker à moins 80 degrés Celsius. Pour effectuer la réaction, recueillir 10 femtomole chacun de P5E, PME et P3E et 20 femtomole du vecteur de destination PDEST. Identifier la taille des quatre vecteurs et paires de bases à partir de la source plasmidique.Après avoir déterminé la concentration des quatre vecteurs, en utilisant le poids de l’ADN comme 660 grammes par mole et la taille du plasmide et les paires de bases, calculer le nombre total de nanogrammes de plasmide nécessaires pour atteindre 10 femtomole pour les vecteurs d’entrée ou 20 femtomole pour le vecteur de destination. Ensuite, générez la construction sox17:EGFP-CAAX en utilisant les composants décrits dans le manuscrit. En utilisant la concentration plasmidique, calculez les microlitres totaux de chaque plasmide nécessaires pour atteindre 10 femtomole ou 20 femtomole, puis divisez cela par deux pour l’utilisation dans les réactions de demi-LR de cinq microlitres.Générer 10 femtomole de P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) et 20 femtomole de vecteur de destination. Mettre en place cinq microlitres de réaction demi-LR en combinant les volumes de P5E, PME, P3E et PDEST dans un tube de 500 microlitres. Ajoutez ensuite de l’eau stérile pour faire le volume quatre microlitres.Vortex le mélange d’enzymes LR deux fois pendant une minute chacun avant d’ajouter un microlitre à la réaction et bien mélanger avant d’incuber à 25 degrés Celsius. Le lendemain, arrêtez la réaction LR en ajoutant 0,5 microlitre de protéinase K.Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis refroidir à température ambiante. Ensuite, transformez trois à quatre microlitres du plasmide en cellules chimiquement compétentes décongelées en ajoutant le plasmide et en laissant les cellules reposer sur de la glace pendant 25 à 30 minutes.Ensuite, choc thermique les cellules dans un bain-marie de 42 degrés Celsius pendant 30 secondes. Après le choc thermique, ajoutez 250 microlitres de milieux liquides riches sans antibiotiques aux cellules et incuber en agitant à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Étaler 300 microlitres de suspension bactérienne sur une plaque d’ampicilline Luria-Bertani et incuber pendant une nuit.Le lendemain, dépister les colonies pour détecter la présence de deux phénotypes : clair et opaque. Choisissez les colonies claires une à la fois, inoculez la culture liquide et agitez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Combinez 150 nanogrammes de plasmide, 100 nanogrammes d’ARNm de transposase et 2% de rouge de phénol sur glace.Ajoutez ensuite de l’eau sans ARN pour obtenir un volume de trois microlitres. Transférer un embryon au stade cellulaire à l’aide de pipettes de transfert dans la plaque d’injection remplie d’EM recouvrant complètement la gélose puis appuyer doucement sur environ 50 à 75 embryons par fente de la plaque d’injection. Ajouter le mélange de rouge de phénol plasmidique d’ARNm à l’extrémité ouverte d’une aiguille d’injection capillaire.Placez l’aiguille capillaire dans l’armature de l’appareil d’injection et allumez l’appareil d’injection. Abaissez l’aiguille dans la plaque d’injection et cassez l’embout à l’aide d’une pince pour ne permettre qu’à une petite quantité de mélange d’être pompée par l’appareil d’injection. Injectez aux embryons un bolus de trois nanolitres du mélange de rouge de phénol plasmidique d’ARNm dans le corps cellulaire de l’embryon.Lorsque vous avez terminé, retirez les embryons de la plaque d’injection en les sortant doucement de la fente et transférez-les en les pipetant dans une boîte de Petri de 100 millimètres avec EM frais. Incuber à 28,5 degrés Celsius. Choisissez le stade de développement approprié pour l’expression des transgènes fluorescents et dépister au microscope à dissection fluorescente. Dépister les transgènes non fluorescents en criblant les marqueurs transgéniques fluorescents tels que la GFP pilotée par le promoteur cardiaque spécifique du gène Cmlc2.Lorsque les embryons positifs pour l’insertion transgénique se développent chez les adultes et atteignent l’âge de reproduction, les dépister individuellement pour la transmission germinale et l’expressivité transgénique en les élevant en poisson zèbre de type sauvage. Des exemples de colonies bactériennes obtenues à partir de la transformation de la recombinaison LR sont présentés. Les colonies transparentes contenaient un produit de recombinaison LR correct plus de 85% du temps, tandis que les colonies opaques ne contenaient jamais de produit de recombinaison correct.La digestion diagnostique des trois colonies à partir de la transformation des produits de recombinaison LR a montré que la seule colonie opaque ne contenait aucun plasmide, tandis que les deux colonies claires contenaient une seule bande à 9 544 paires de bases. L’ARNm transposase à 1 950 paires de bases est illustré ici. L’expression de l’endoderme en mosaïque EGFP-CAAX a été observée dans 75% des embryons injectés.L’expression de marqueurs transgéniques de Cmlc2 EGFP dans le cœur en développement a été observée 24 heures après la fécondation. Le poisson zèbre adulte a eu la transmission germinale d’embryons fluorescents générés par sox17:EGFP-CAAX avec l’endoderme entièrement marqué avec EGFP-CAAX. La longueur antéro-postérieure de l’endoderme et la longueur dorso-ventrale de chaque poche des poches un à cinq ont été mesurées chez des embryons mutants BMP sauvages témoins et traités à l’éthanol.La longueur totale de l’endoderme n’a pas été affectée par le génotype ou le traitement. Cependant, les poches un et trois ont montré des augmentations significatives de la longueur de la poche entre les embryons de type sauvage non traités et traités à l’éthanol, mais des diminutions significatives de la longueur entre les mutants BMP non traités et traités à l’éthanol. La poche deux a montré des augmentations significatives de la taille de la poche entre les groupes de type sauvage non traité et traité à l’éthanol et les groupes mutants BMP respectivement.Lors de la tentative de cette procédure, il est essentiel d’être précis dans le pipetage et la dilution du système Tol2, ainsi que dans le fait de frapper le corps cellulaire pendant l’injection d’embryons.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Imagerie en direct d&#39;Innate immunitaire et prénéoplasiques Interactions cellulaires L&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;expression / UAS inductible Gal4 dans des larves de poisson zèbre peau

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Recherche

Biologie du développement

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Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

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