Name: the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00
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Die in diesem Artikel vorgestellte Forschung wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 an C.B.L. unterstützt.

Alle Zebrafischembryonen, die in diesem Verfahren verwendet wurden, wurden gemäß den etablierten IACUC-Protokollen aufgezogen und gezüchtet12. Diese Protokolle wurden von der University of Louisville genehmigt.
HINWEIS: In dieser Studie wurden der Wildtyp-Zebrafischstamm AB und die Doppelmutantenlinie bmp4 st72;smad5b1100 verwendet. Das gesamte Wasser, das bei diesem Verfahren verwendet wurde, war steriles Umkehrosmosewasser. Konfokale ...

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research.">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+forTol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don, E. 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V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li><li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+transgenesis,+gene+trapping,+enhancer+trapping,+and+Gal4-UAS+system.">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li></ol>

Zebrafische eignen sich hervorragend, um die Auswirkungen einer Ethanolexposition auf Entwicklungs- und Krankheitszustände zu untersuchen 7,8. Zebrafische produzieren eine große Anzahl von durchscheinenden, extern befruchteten, genetisch beherrschbaren Embryonen, was die Live-Bildgebung mehrerer transgenmarkierter Gewebe und Zelltypen gleichzeitig in mehreren Umweltkontexten ermöglicht19,20. Diese Stä...

Die pränatale Ethanolexposition führt zu einem Kontinuum struktureller Defizite und kognitiver Beeinträchtigungen, die als fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) bezeichnet werden1,2,3,4. Die komplexen Beziehungen zwischen mehreren Faktoren machen es schwierig, die Ätiologie von FASD beim Menschen zu untersuchen und zu verstehen. Um diese Herausforderung zu lösen, wurde eine Vielzahl von Tiermodellen verwendet. Die biologischen und experimentellen Werkzeuge, die in diesen Modellen zur Verfügung stehen, haben sich als entscheidend für die Entwicklung unseres Verständnisses der mechanistischen Grundlagen der Ethanol-Teratogenität erwiesen, und die Ergebnisse dieser Modellsysteme stimmen bemerkenswert mit dem überein, was in humanen Ethanolstudien gefunden wurde 5,6. Unter diesen haben sich Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modell für die Untersuchung der Ethanol-Teratogeneseentwickelt 7,8, was zum Teil auf ihre externe Befruchtung, ihre hohe Fruchtbarkeit, ihre genetische Lenkbarkeit und ihre durchscheinenden Embryonen zurückzuführen ist. Diese Stärken zusammen machen Zebrafische ideal für Echtzeit-Live-Bildgebungsstudien von FASD mit transgenen Zebrafischlinien.
Transgene Zebrafische wurden ausgiebig verwendet, um verschiedene Aspekte der Embryonalentwicklung zu untersuchen9. Die Herstellung transgener Konstrukte und nachfolgender transgener Linien kann jedoch äußerst schwierig sein. Ein Standard-Transgen benötigt ein aktives Promotorelement, um das Transgen anzutreiben, und ein Poly-A-Signal oder einen "Schwanz", alles in einem stabilen bakteriellen Vektor für die allgemeine Vektorerhaltung. Die traditionelle Erzeugung eines transgenen Mehrkomponentenkonstrukts erfordert mehrere zeitaufwändige Unterklonierungsschritte10. PCR-basierte Ansätze, wie z. B. die Gibson-Assemblierung, können einige der Probleme umgehen, die mit dem Subklonen verbunden sind. Für die Erzeugung jedes einzigartigen transgenen Konstrukts müssen jedoch einzigartige Primer entworfen und getestet werden10. Neben der Konstruktion von Transgenen waren auch die genomische Integration, die Übertragung der Keimbahn und das Screening auf eine ordnungsgemäße Transgenintegration schwierig. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung des Transposon-basierten Tol2-Transgenesesystems (Tol2Kit)10,11. Dieses modulare System nutzt das Klonen von Gateways an mehreren Standorten, um schnell mehrere transgene Konstrukte aus einer ständig wachsenden Bibliothek von "Eingangs"- und "Ziel"-Vektoren zu generieren. Integrierte Tol2-transponierbare Elemente erhöhen die Transgeneserate erheblich und ermöglichen die schnelle Konstruktion und genomische Integration mehrerer Transgene. Mit Hilfe dieses Systems zeigen wir, wie die Generierung einer endodermen transgenen Zebrafischlinie genutzt werden kann, um die gewebespezifischen strukturellen Defekte zu untersuchen, die FASD zugrunde liegen. Letztendlich zeigen wir in diesem Protokoll, dass der modulare Aufbau und die Konstruktion transgener Konstrukte die FASD-Forschung auf Zebrafischbasis sehr unterstützen werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene Tol2 toolbox</td>
			<td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided directly by the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>2486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Dissecting Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lawsone Lab Donor Plasmid Prep</td>
			<td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II Plus Enzyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12538200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipette holder</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MIMPH-M-PIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 0.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet</td>
			<td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4758-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup .22 &#181;m vacuum filtration system&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU11RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2 Wiki Page</td>
			<td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipetter Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>i34</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach

Fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) sind durch eine sehr variable Reihe von strukturellen Defekten und kognitiven Beeinträchtigungen gekennzeichnet, die aufgrund einer pränatalen Ethanolexposition auftreten. Aufgrund der komplexen Pathologie von FASD haben sich Tiermodelle als entscheidend für unser aktuelles Verständnis von Ethanol-induzierten Entwicklungsdefekten erwiesen. Zebrafische haben sich aufgrund des hohen Erhaltungsgrades sowohl der Genetik als auch der Entwicklung zwischen Zebrafisch und Mensch als leistungsfähiges Modell zur Untersuchung ethanolinduzierter Entwicklungsdefekte erwiesen. Als Modellsystem besitzen Zebrafische viele Eigenschaften, die sie ideal für Entwicklungsstudien machen, darunter eine große Anzahl von extern befruchteten Embryonen, die genetisch beherrschbar und durchscheinend sind. Dies ermöglicht es den Forschern, den Zeitpunkt und die Dosierung der Ethanolexposition in mehreren genetischen Kontexten genau zu steuern. Ein wichtiges genetisches Werkzeug, das im Zebrafisch zur Verfügung steht, ist die Transgenese. Die Generierung transgener Konstrukte und die Etablierung transgener Linien kann jedoch komplex und schwierig sein. Um dieses Problem zu lösen, haben Zebrafischforscher das Transposon-basierte Tol2-Transgenesesystem etabliert. Dieses modulare System verwendet einen Multisite-Gateway-Klonierungsansatz für den schnellen Zusammenbau kompletter Tol2-Transposon-basierter transgener Konstrukte. Hier beschreiben wir die flexible Tol2-System-Toolbox und ein Protokoll zur Generierung transgener Konstrukte, die für die Zebrafisch-Transgenese und deren Verwendung in Ethanolstudien bereit sind.

Um die transgenen Konstrukte zu generieren, verwendeten wir das Tol2-Transgenese-System. Drei Eintrittsvektoren, darunter p5E, das die Genpromotor/Enhancer-Elemente enthält, pME, das das Gen enthält, das von den Promotor/Enhancer-Elementen exprimiert werden soll, und p3E, das mindestens den polyA-Schwanz enthält, wurden verwendet, um das transgene Konstrukt über Multisite-Gateway-LR-Klonierung zu generieren. Der Zielvektor pDest liefert die Tol2-Wiederholungen für die genomische Insertion des transgenen Kon...

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The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für das modulare Tol2-Transgenese-System, eine Gateway-basierte Klonierungsmethode zur Herstellung und Injektion transgener Konstrukte in Zebrafischembryonen.

Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Transgene Zebrafische haben sich als entscheidend für unser Verständnis der Embryonalentwicklung erwiesen. Das Tol2-System ist ein vielseitiges Werkzeug, das es Forschern ermöglicht, schnell und systematisch mehrere transgene Zebrafische für FASD-Studien zu generieren. Der modulare Aufbau und die einfache Generierung neuer Kit-Komponenten machen das Tol2-System zu einem vielseitigen Werkzeug für die Generierung neuer Transgenetik, ohne dass Komponenten des Kits neu entworfen werden müssen.Mein Rat an Forscher, die diese Technik zum ersten Mal anwenden, ist, mehrere Testläufe durchzuführen, um die Präzision der Erzeugung und Injektion transgener Konstrukte zu trainieren. Linearisieren Sie zunächst das Tol2-Kit-Plasmid, das Transposase enthält, mit einer Endonuklease mit einer Restriktionsendonuklease von null, indem 10 Mikroliter Transposase-Plasmid, 1,5 Mikroliter Restriktionsendonuklease-Reaktionspuffer und 0,3 Mikroliter Null-Eins-Endonuklease in einem 500-Mikrozentrifugen-Röhrchen kombiniert werden. Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 Mikroliter mit RNAse-freiem Wasser.Mischen und bei 37 Grad Celsius über Nacht verdauen. Stoppen Sie am nächsten Tag den Aufschluss, indem Sie dem Reaktionsgemisch einen Mikroliter 0,5 molaren EDTA, zwei Mikroliter fünfmolaren Ammoniumacetat und 80 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzufügen. Mixen und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius kalt stellen.Zentrifugieren und aspirieren Sie den Überstand am nächsten Tag, bevor Sie das DNA-Pellet in RNAse-freiem Wasser resuspendieren. Bestimmen Sie dann die lineare Plasmidkonzentration in Nanogramm pro Mikroliter auf einem Fluorometer, indem Sie zwei Mikroliter der Probe laufen lassen. Richten Sie die SP6-mRNA-Produktion ein, indem Sie 10 Mikroliter 2X NTP/CAP, zwei Mikroliter 10X-Reaktionspuffer, 0,1 bis ein Mikrogramm lineare DNA-Matrize in zwei Mikrolitern SP6-Enzymmischung in einem 500-Mikroliter-Röhrchen kombinieren.Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 Mikroliter mit RNAse-freiem Wasser und mischen Sie sie vor der Inkubation bei 37 Grad Celsius. Nach zwei Stunden einen Mikroliter DNAse hinzufügen, gut mischen und weitere 15 Minuten inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 30 Mikroliter Lithiumchlorid-Fällungslösung hinzufügen.Mixen und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius kalt stellen. Zentrifugieren Sie am nächsten Tag die Lösung, um die mRNA zu pelletieren, und saugen Sie den Überstand an, bevor Sie das Pellet mit einem Milliliter 80%igem Ethanol waschen. Trocknen Sie das Pellet an der Luft und resuspendieren Sie es in 20 Mikrolitern RNAse-freiem Wasser.Bestimmen Sie die mRNA-Konzentration mit einem Fluorometer, aliquotieren Sie dann 100 Nanogramm mRNA pro Röhrchen für den einmaligen Gebrauch und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Um die Reaktion durchzuführen, sammeln Sie jeweils 10 Femtomole von P5E, PME und P3E und 20 Femtomol des Zielvektors PDEST. Bestimmen Sie die Größe aller vier Vektoren und Basenpaare aus der Plasmidquelle.Nachdem Sie die Konzentration aller vier Vektoren unter Verwendung des Gewichts der DNA von 660 Gramm pro Mol und der Plasmidgröße und der Basenpaare bestimmt haben, berechnen Sie die gesamten Nanogramm Plasmid, die benötigt werden, um entweder 10 Femtomol für Eintrittsvektoren oder 20 Femtomol für Zielvektoren zu erreichen. Als nächstes generieren Sie das Konstrukt sox17:EGFP-CAAX unter Verwendung der im Manuskript beschriebenen Komponenten. Berechnen Sie anhand der Plasmidkonzentration die gesamten Mikroliter jedes Plasmids, die benötigt werden, um entweder 10 Femtomol oder 20 Femtomol zu erreichen, und teilen Sie diese dann durch zwei für die Verwendung in den Fünf-Mikroliter-Halb-LR-Reaktionen.Erzeugen Sie 10 Femtomol P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) und 20 Femtomol Zielvektor. Richten Sie eine fünf-Mikroliter-Halb-LR-Reaktion ein, indem Sie die Volumina von P5E, PME, P3E und PDEST in einem 500-Mikroliter-Röhrchen kombinieren. Fügen Sie dann steriles Wasser hinzu, um das Volumen auf vier Mikroliter zu erhöhen.Wirbeln Sie die LR-Enzymmischung zweimal für jeweils eine Minute vortex, bevor Sie der Reaktion einen Mikroliter hinzufügen, und mischen Sie sie gründlich, bevor Sie bei 25 Grad Celsius inkubieren. Stoppen Sie am nächsten Tag die LR-Reaktion durch Zugabe von 0,5 Mikrolitern Proteinase K.10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen. Als nächstes wandeln Sie drei bis vier Mikroliter des Plasmids in aufgetaute chemisch kompetente Zellen um, indem Sie das Plasmid hinzufügen und die Zellen 25 bis 30 Minuten auf Eis ruhen lassen.Anschließend werden die Zellen in einem 42 Grad Celsius warmen Wasserbad für 30 Sekunden erhitzt. Nach dem Hitzeschock 250 Mikroliter antibiotikafreie, reichhaltige flüssige Medien in die Zellen geben und unter Schütteln bei 37 Grad Celsius 1,5 Stunden inkubieren. Verteilen Sie 300 Mikroliter Bakteriensuspension auf einer Ampicillin-Luria-Bertani-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht.Untersuchen Sie die Kolonien am nächsten Tag auf das Vorhandensein von zwei Phänotypen: klar und undurchsichtig. Pflücken Sie die klaren Kolonien nacheinander, beimpfen Sie die Flüssigkultur und schütteln Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Kombinieren Sie 150 Nanogramm Plasmid, 100 Nanogramm Transposase-mRNA und 2 % Phenolrot auf Eis.Fügen Sie dann RNA-freies Wasser hinzu, um das Volumen auf drei Mikroliter zu erhöhen. Übertragen Sie einen Embryo im Zellstadium mit Transferpipetten auf die mit EM gefüllte Injektionsplatte, die den Agar vollständig bedeckt, und drücken Sie dann vorsichtig etwa 50 bis 75 Embryonen pro Schlitz der Injektionsplatte. Geben Sie die mRNA-Plasmid-Phenolrot-Mischung auf das offene Ende einer Kapillarinjektionsnadel.Setzen Sie die Kapillarnadel in die Armatur der Injektionsanlage ein und schalten Sie die Injektionsanlage ein. Senken Sie die Nadel in die Injektionsplatte und brechen Sie die Spitze mit einer Pinzette, damit nur eine kleine Menge des Gemisches von der Injektionsanlage abgepumpt werden kann. Injizieren Sie den Embryonen einen drei Nanoliter großen Bolus der mRNA-Plasmid-Phenol-Rot-Mischung in den Zellkörper des Embryos.Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Embryonen von der Injektionsplatte, indem Sie sie vorsichtig aus dem Schlitz nehmen und pipettieren Sie sie in eine 100-Millimeter-Petrischale mit frischem EM. Inkubieren bei 28,5 Grad Celsius. Wählen Sie das geeignete Entwicklungsstadium für die Fluoreszenztransgenexpression aus und screenen Sie es unter einem Fluoreszenzpräparationsmikroskop. Screening auf nicht-fluoreszierende Transgene durch Screening auf fluoreszierende transgene Marker wie GFP, die durch den kardialen Promotor für das Gen Cmlc2 gesteuert werden.Wenn sich die Embryonen, die für die transgene Insertion positiv sind, zu erwachsenen Embryonen entwickeln und das Zuchtalter erreichen, werden sie einzeln auf Keimbahnübertragung und Transgenexpressivität untersucht, indem sie mit Wildtyp-Zebrafischen verpaart werden. Beispielhaft werden Bakterienkolonien gezeigt, die aus der Transformation der LR-Rekombination gewonnen wurden. Klare Kolonien enthielten in mehr als 85 % der Fälle ein korrektes LR-Rekombinationsprodukt, während undurchsichtige Kolonien nie ein korrektes Rekombinationsprodukt enthielten.Die diagnostische Verdauung der drei Kolonien aus der Transformation der LR-Rekombinationsprodukte zeigte, dass die einzelne opake Kolonie kein Plasmid enthielt, während die beiden klaren Kolonien eine einzelne Bande bei 9,544 Basenpaaren enthielten. Die Transposase-mRNA bei 1,950 Basenpaaren ist hier dargestellt. Die Expression des Mosaik-Endoderms EGFP-CAAX wurde bei 75% der injizierten Embryonen beobachtet.Die transgene Markerexpression von Cmlc2 EGFP im sich entwickelnden Herzen wurde 24 Stunden nach der Befruchtung beobachtet. Adulte Zebrafische wiesen eine Keimbahnübertragung von sox17:EGFP-CAAX erzeugten fluoreszierenden Embryonen auf, wobei das Endoderm vollständig mit EGFP-CAAX markiert war. Sowohl die anterior-posteriore Länge des Endoderms als auch die dorsal-ventrale Länge jedes Beutels aus den Beuteln eins bis fünf wurden in Kontroll- und Ethanol-behandelten Wildtyp-BMP-mutierten Embryonen gemessen.Die Gesamtlänge des Endoderms wurde weder durch den Genotyp noch durch die Behandlung beeinflusst. Die Beutel eins und drei zeigten jedoch eine signifikante Zunahme der Beutellänge zwischen unbehandelten und mit Ethanol behandelten Wildtyp-Embryonen, aber eine signifikante Abnahme der Länge zwischen unbehandelten und ethanolbehandelten BMP-Mutanten. Beutel zwei zeigte signifikante Anstiege der Beutelgröße zwischen der unbehandelten und der ethanolbehandelten Wildtyp- bzw. BMP-Mutantengruppe.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, beim Pipettieren und Verdünnen des Tol2-Systems sowie beim Berühren des Zellkörpers während der Embryoinjektion präzise vorzugehen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

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Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

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Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

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