Name: the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach at JoVE.com

A pesquisa apresentada neste artigo foi apoiada por uma bolsa do National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 para C.B.L.

Todos os embriões de zebrafish utilizados neste procedimento foram criados e criados seguindo os protocolos estabelecidos pela IACUC12. Esses protocolos foram aprovados pela Universidade de Louisville.
NOTA: A linhagem de peixe-zebra selvagem, AB, e a linhagem dupla mutante bmp4st72;smad5b1100 foram usadas neste estudo. Toda a água utilizada neste procedimento foi água de osmose reversa estéril. As imagens confocais foram obtidas em mi...

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V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li><li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+transgenesis,+gene+trapping,+enhancer+trapping,+and+Gal4-UAS+system.">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li></ol>

Os peixes-zebra são ideais para estudar o impacto da exposição ao etanol no desenvolvimento e estados de doença 7,8. Os peixes-zebra produzem um grande número de embriões translúcidos, fertilizados externamente e geneticamente tratáveis, o que permite a obtenção de imagens vivas de vários tecidos e tipos celulares marcados com transgenes simultaneamente em múltiplos contextos ambientais19,20. ...

A exposição pré-natal ao etanol dá origem a um continuum de déficits estruturais e comprometimentos cognitivos denominados transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF)1,2,3,4. As complexas relações entre múltiplos fatores tornam o estudo e a compreensão da etiologia do TEAF em humanos um desafio. Para resolver esse desafio, uma grande variedade de modelos animais tem sido utilizada. As ferramentas biológicas e experimentais disponíveis nesses modelos têm se mostrado cruciais no desenvolvimento de nossa compreensão das bases mecanicistas da teratogenicidade do etanol, e os resultados desses sistemas modelo têm sido notavelmente consistentes com o que é encontrado em estudos com etanol humano 5,6. Dentre estes, o zebrafish tem emergido como um poderoso modelo para o estudo da teratogênese do etanol7,8, em parte devido à sua fecundação externa, alta fecundidade, tratabilidade genética e embriões translúcidos. Esses pontos fortes se combinam para tornar o peixe-zebra ideal para estudos de imagem ao vivo em tempo real do FASD usando linhas transgênicas de peixe-zebra.
O peixe-zebra transgênico tem sido extensivamente utilizado para estudar múltiplos aspectos do desenvolvimento embrionário9. No entanto, criar construções transgênicas e linhas transgênicas subsequentes pode ser extremamente difícil. Um transgene padrão requer um elemento promotor ativo para conduzir o transgene e um sinal poli A ou "cauda", tudo em um vetor bacteriano estável para manutenção geral do vetor. A geração tradicional de uma construção transgênica multicomponente requer várias etapas demoradas de subclonagem10. Abordagens baseadas em PCR, como a montagem Gibson, podem contornar alguns dos problemas associados à subclonagem. No entanto, primers únicos devem ser projetados e testados para a geração de cada construção transgênica única10. Além da construção de transgenes, a integração genômica, a transmissão germinativa e a triagem para a integração adequada de transgenes também têm sido difíceis. Descrevemos aqui um protocolo para utilização do sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon (Tol2Kit)10,11. Este sistema modular usa clonagem de Gateway multissite para gerar rapidamente várias construções transgênicas a partir de uma biblioteca em constante expansão de vetores de "entrada" e "destino". Os elementos transponíveis integrados Tol2 aumentam consideravelmente a taxa de transgênese, permitindo a rápida construção e integração genômica de múltiplos transgenes. Usando este sistema, mostramos como a geração de uma linhagem de zebrafish transgênico endoderme pode ser usada para estudar os defeitos estruturais tecido-específicos subjacentes ao TEAF. Em última análise, neste protocolo, mostramos que a configuração modular e a construção de construções transgênicas ajudarão muito a pesquisa de FASD baseada em peixe-zebra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene Tol2 toolbox</td>
			<td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided directly by the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>2486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Dissecting Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lawsone Lab Donor Plasmid Prep</td>
			<td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II Plus Enzyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12538200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipette holder</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MIMPH-M-PIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 0.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet</td>
			<td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4758-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup .22 &#181;m vacuum filtration system&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU11RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2 Wiki Page</td>
			<td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipetter Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>i34</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach

Os transtornos do espectro alcoólico fetal (TEAF) são caracterizados por um conjunto altamente variável de defeitos estruturais e prejuízos cognitivos que surgem devido à exposição pré-natal ao etanol. Devido à complexa patologia do TEAF, modelos animais têm se mostrado críticos para nossa compreensão atual dos defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol. O peixe-zebra provou ser um modelo poderoso para examinar defeitos de desenvolvimento induzidos pelo etanol devido ao alto grau de conservação da genética e do desenvolvimento entre peixes-zebra e humanos. Como um sistema modelo, o peixe-zebra possui muitos atributos que os tornam ideais para estudos de desenvolvimento, incluindo um grande número de embriões fertilizados externamente que são geneticamente tratáveis e translúcidos. Isso permite que os pesquisadores controlem com precisão o tempo e a dosagem da exposição ao etanol em vários contextos genéticos. Uma importante ferramenta genética disponível no peixe-zebra é a transgênese. No entanto, gerar construções transgênicas e estabelecer linhagens transgênicas pode ser complexo e difícil. Para resolver essa questão, os pesquisadores do peixe-zebra estabeleceram o sistema de transgênese Tol2 baseado em transposon. Este sistema modular usa uma abordagem de clonagem de Gateway multisite para a montagem rápida de construções transgênicas completas baseadas em transposon Tol2. Aqui, descrevemos a caixa de ferramentas do sistema flexível Tol2 e um protocolo para geração de construções transgênicas prontas para a transgênese de peixe-zebra e seu uso em estudos de etanol.

Para gerar as construções transgênicas, foi utilizado o sistema de transgênese Tol2. Três vetores de entrada, incluindo p5E, que contém os elementos promotores/potencializadores do gene, pME, que mantém o gene a ser expresso pelos elementos promotores/intensificadores, e p3E, que, no mínimo, contém a cauda poliA, foram usados para gerar a construção transgênica via clonagem LR de gateway multissite. O vetor de destino, pDest, fornece as repetições de Tol2 para a inserção genômica da construção...

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The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Este trabalho descreve um protocolo para o sistema modular de transgênese Tol2, um método de clonagem baseado em gateway para criar e injetar construções transgênicas em embriões de peixe-zebra.

O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Os peixes-zebra transgênicos têm se mostrado fundamentais para nossa compreensão do desenvolvimento embrionário. O sistema Tol2 é uma ferramenta versátil que permite aos pesquisadores gerar de forma rápida e sistemática múltiplos peixes-zebra transgênicos para estudos de FASD. O design modular e a facilidade de gerar novos componentes do kit tornam o sistema Tol2 uma ferramenta versátil para gerar novos transgênicos sem ter que redesenhar nenhum componente do kit.Meu conselho aos pesquisadores que realizam essa técnica pela primeira vez é fazer vários testes para treinar a precisão de gerar e injetar construções transgênicas. Para começar, linearize o plasmídeo do kit Tol2 contendo transposase com uma endonuclease de restrição nought one combinando 10 microlitros de plasmídeo transposase, 1,5 microlitros de tampão de reação de endonuclease de restrição e 0,3 microlitros de endonuclease nought one endonuclease em um tubo de microcentrífuga de 500 microlitros. Encha a reação até 20 microlitros com água sem RNAse.Misture e digerir a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, interrompa a digestão adicionando um microlitro de EDTA 0,5 molar, dois microlitros de acetato de amônio cinco molares e 80 microlitros de etanol 100% à mistura de reação. Misture e resfrie a menos 20 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, centrifugar e aspirar o sobrenadante antes de ressuspender a pelota de DNA em água livre de RNAse. Em seguida, determine a concentração de plasmídeo linear em nanogramas por microlitro em um fluorômetro executando dois microlitros da amostra. Configure a produção de mRNA SP6 combinando 10 microlitros de 2X NTP/CAP, dois microlitros de tampão de reação 10X, 0,1 a um micrograma de molde de DNA linear em dois microlitros de mistura enzimática SP6 em um tubo de 500 microlitros.Encha a reação até 20 microlitros com água sem RNAse e misture antes de incubar a 37 graus Celsius. Após duas horas, adicione um microlitro de DNAse, misture bem e incube por mais 15 minutos. Pare a reação adicionando 30 microlitros de solução de precipitação de cloreto de lítio.Misture e resfrie a menos 20 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, centrifugar a solução para pellet do mRNA e aspirar o sobrenadante antes de lavar o pellet com um mililitro de etanol 80%. Seque o pellet ao ar e ressuspenda-o em 20 microlitros de água livre de RNAse.Determine a concentração de mRNA usando um fluorômetro e, em seguida, alíquota 100 nanogramas de mRNA por tubo para uso único e armazene a menos 80 graus Celsius. Para realizar a reação, reunir 10 femtomole cada de P5E, PME e P3E e 20 femtomole do vetor de destino PDEST. Identificar o tamanho de todos os quatro vetores e pares de bases da fonte de plasmídeo.Depois de determinar a concentração de todos os quatro vetores, usando o peso do DNA como 660 gramas por mol e tamanho do plasmídeo e pares de bases, calcule o total de nanogramas de plasmídeo necessários para atingir 10 femtomole para vetores de entrada ou 20 femtomole para vetor de destino. Em seguida, gere o construto sox17:EGFP-CAAX usando os componentes descritos no manuscrito. Usando a concentração plasmidial, calcule o total de microlitros de cada plasmídeo necessário para atingir 10 femtomole ou 20 femtomole e, em seguida, divida isso por dois para o uso nas reações de cinco microlitros de meio LR.Gerar 10 femtomole de P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) e 20 femtomole do vetor de destino. Configure cinco microlitros de reação meio LR combinando os volumes do P5E, PME, P3E e PDEST em um tubo de 500 microlitros. Em seguida, adicione água estéril para fazer o volume de quatro microlitros.Vórtice a enzima LR misturar duas vezes por um minuto cada antes de adicionar um microlitro à reação e misturar completamente antes de incubar a 25 graus Celsius. No dia seguinte, pare a reação LR adicionando 0,5 microlitros de proteinase K.Incube a 37 graus Celsius por 10 minutos e depois resfrie até a temperatura ambiente. Em seguida, transforme três a quatro microlitros do plasmídeo em células quimicamente competentes descongeladas, adicionando o plasmídeo e deixando as células ficarem no gelo por 25 a 30 minutos.Em seguida, choque térmico as células em banho-maria de 42 graus Celsius por 30 segundos. Após o choque térmico, adicione 250 microlitros de meio líquido rico sem antibióticos às células e incube com agitação a 37 graus Celsius por 1,5 horas. Espalhe 300 microlitros de suspensão bacteriana em uma placa de ampicilina Luria-Bertani e incube durante a noite.No dia seguinte, rastreie as colônias para a presença de dois fenótipos: claro e opaco. Escolha as colônias claras, uma de cada vez, inocular a cultura líquida e agite a 37 graus Celsius durante a noite. Combine 150 nanogramas de plasmídeo, 100 nanogramas de mRNA de transposase e 2% de vermelho de fenol no gelo.Em seguida, adicione água sem RNA para fazer o volume de três microlitros. Transfira um embrião em estágio celular usando pipetas de transferência para a placa de injeção preenchida com EM cobrindo completamente o ágar e, em seguida, pressione suavemente aproximadamente 50 a 75 embriões por slot da placa de injeção. Adicione a mistura de vermelho de fenol plasmidial de mRNA à extremidade aberta de uma agulha de injeção capilar.Coloque a agulha capilar na armadura da plataforma de injeção e ligue a plataforma de injeção. Abaixe a agulha para dentro da placa de injeção e quebre a ponta usando pinças para permitir que apenas uma pequena quantidade de mistura seja bombeada para fora pelo equipamento de injeção. Injetar os embriões com um bolus de três nanolitros da mistura vermelha de fenol plasmidial de mRNA no corpo celular do embrião.Quando terminar, remova os embriões da placa de injeção retirando-os suavemente da ranhura e transfira-os para uma placa de Petri de 100 milímetros com EM fresco. Incubar a 28,5 graus Celsius. Escolha o estágio de desenvolvimento apropriado para a expressão de transgenes fluorescentes e faça a triagem em um microscópio dissecante fluorescente. Triagem de transgenes não fluorescentes por triagem de marcadores transgênicos fluorescentes, como GFP, impulsionada pelo promotor cardíaco-específico para o gene Cmlc2.Quando os embriões positivos para inserção transgênica se desenvolverem em adultos e atingirem a idade reprodutiva, selecione-os individualmente para transmissão germinativa e expressividade transgênica, reproduzindo-os para peixes-zebra selvagens. Exemplos de colônias bacterianas obtidas a partir da transformação da recombinação LR são mostrados. As colônias claras continham um produto de recombinação LR correto mais de 85% do tempo, enquanto as colônias opacas nunca continham um produto de recombinação correto.A digestão diagnóstica das três colônias a partir da transformação dos produtos da recombinação LR mostrou que a única colônia opaca não continha nenhum plasmídeo, enquanto as duas colônias claras continham uma única banda em 9.544 pares de bases. O mRNA transposase em 1, 950 pares de bases é mostrado aqui. A expressão do EGFP-CAAX no endoderme em mosaico foi observada em 75% dos embriões injetados.A expressão transgênica do EGFP Cmlc2 no coração em desenvolvimento foi observada 24 horas após a fecundação. Zebrafish adultos tiveram transmissão germinativa de embriões fluorescentes gerados por sox17:EGFP-CAAX com a endoderme totalmente marcada com EGFP-CAAX. Tanto o comprimento anteroposterior da endoderme quanto o comprimento dorso-ventral de cada bolsa das bolsas um a cinco foram medidos em embriões mutantes de BMP selvagens do tipo controle e tratados com etanol.O comprimento total da endoderme não foi afetado pelo genótipo ou tratamento. No entanto, as bolsas um e três mostraram aumentos significativos no comprimento da bolsa entre embriões selvagens não tratados e tratados com etanol, mas diminuições significativas no comprimento entre mutantes BMP não tratados e tratados com etanol. A bolsa dois mostrou aumentos significativos no tamanho da bolsa entre os grupos selvagem não tratado e tratado com etanol e mutante BMP, respectivamente.Ao tentar este procedimento, é fundamental ser preciso na pipetagem e diluição do sistema Tol2, bem como atingir o corpo celular durante a injeção do embrião.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Imagens ao vivo da imunológica inata e pré-neoplásicas Interações de células utilizando um / UAS Expression System Inducible Gal4 em larvas de peixe-zebra da pele

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Biologia do Desenvolvimento

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Mosaic Zebrafish Transgénese para Análise Funcional Genomic de candidatos Genes de cooperação em Tumor Patogênese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Encapsulation alginato de pluripotentes células estaminais utilizando um bocal Co-axial

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...