Name: the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach at JoVE.com

Forskningen som presenteras i denna artikel stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 till CBL

Alla zebrafiskembryon som användes i detta förfarande uppföddes och förädlades enligt fastställda IACUC-protokoll12. Dessa protokoll godkändes av University of Louisville.
OBS: Den vilda zebrafiskstammen, AB, och bmp4st72;smad5b1100 dubbelmutantlinjen användes i denna studie. Allt vatten som användes i denna procedur var sterilt omvänd osmosvatten. Konfokala bilder togs under ett laserskannande konfokalmikroskop. Endodermmätning...

<ol>
	<li>Denny, L., Coles, S., Blitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+syndrome+and+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders.</a> American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).</li><li>Popova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comorbidity+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).</li><li>Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+spectrum+disorders:+Characteristics,+complications,+and+treatment.">Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment.</a> Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).</li><li>Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+presentation,+diagnosis,+and+management+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder.</a> The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).</li><li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors.">A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).</li><li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+gene-alcohol+interactions.">Animal models of gene-alcohol interactions.</a> Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).</li><li>Fernandes, Y., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Genesis. 59 (11), 23460 (2021).</li><li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis:+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li><li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research.">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+forTol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tol2+gateway-compatible+toolbox+for+the+study+of+the+nervous+system+and+neurodegenerative+disease.">A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease.</a> Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Protocols. UMass Chan Medical School Available from: <a target="_blank" href="https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols">https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols</a> (2017)</li><li>Mosimann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+gateway+calculations:+Excel+spreadsheet.">Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet.</a> protocols.io. , (2022).</li><li>Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-endodermal+interactions+are+required+for+pancreatic+&#946;+cell+induction.">Intra-endodermal interactions are required for pancreatic &#946; cell induction.</a> Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).</li><li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish.">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li><li>Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+(Danio+rerio)+as+an+emerging+model+system+in+ecotoxicology+and+toxicology:+Historical+review,+recent+advances,+and+trends.">Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends.</a> Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).</li><li>Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+the+toxicant+screening+model:+Transgenic+and+omics+approaches.">Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches.</a> Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).</li><li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li><li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+transgenesis,+gene+trapping,+enhancer+trapping,+and+Gal4-UAS+system.">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li></ol>

Zebrafiskar är idealiska för att studera effekterna av etanolexponering på utvecklings- och sjukdomstillstånd 7,8. Zebrafisk producerar ett stort antal genomskinliga, externt befruktade, genetiskt lätthanterliga embryon, vilket möjliggör levande avbildning av flera transgenmärkta vävnader och celltyper samtidigt i flera miljösammanhang19,20. Dessa styrkor, i kombination med det starka utveckling...

Prenatal etanolexponering ger upphov till ett kontinuum av strukturella underskott och kognitiva funktionsnedsättningar som kallas fetalt alkoholspektrumstörningar (FASD)1,2,3,4. De komplexa relationerna mellan flera faktorer gör det svårt att studera och förstå etiologin för FASD hos människor. För att lösa denna utmaning har en mängd olika djurmodeller använts. De biologiska och experimentella verktyg som finns tillgängliga i dessa modeller har visat sig vara avgörande för att utveckla vår förståelse av den mekanistiska grunden för etanolteratogenicitet, och resultaten från dessa modellsystem har varit anmärkningsvärt överensstämmande med vad som finns i humana etanolstudier 5,6. Bland dessa har zebrafiskar framkommit som en kraftfull modell för att studera etanolteratogenes7,8, delvis på grund av deras yttre befruktning, hög fecunditet, genetisk smidighet och genomskinliga embryon. Dessa styrkor kombineras för att göra zebrafiskar idealiska för realtidsstudier av FASD med transgena zebrafisklinjer.
Transgena zebrafiskar har använts i stor utsträckning för att studera flera aspekter av embryonal utveckling9. Att skapa transgena konstruktioner och efterföljande transgena linjer kan dock vara mycket svårt. En standardtransgen kräver ett aktivt promotorelement för att driva transgenen och en poly A-signal eller "svans", allt i en stabil bakterievektor för allmänt vektorunderhåll. Den traditionella genereringen av en multikomponenttransgen konstruktion kräver flera tidskrävande underkloning steg10. PCR-baserade metoder, såsom Gibson-montering, kan kringgå några av de problem som är förknippade med subkloning. Unika primers måste dock utformas och testas för generering av varje unik transgen konstruktion10. Utöver transgenkonstruktion har genomisk integration, överföring av könsceller och screening för korrekt transgenintegration också varit svårt. Här beskriver vi ett protokoll för användning av det transposonbaserade Tol2-transgenessystemet (Tol2Kit)10,11. Detta modulära system använder multisite Gateway-kloning för att snabbt generera flera transgena konstruktioner från ett ständigt växande bibliotek med "entry" och "destination" -vektorer. Integrerade transponerbara Tol2-element ökar kraftigt transgeneshastigheten, vilket möjliggör snabb konstruktion och genomisk integration av flera transgener. Med hjälp av detta system visar vi hur genereringen av en endoderm transgen zebrafisklinje kan användas för att studera de vävnadsspecifika strukturella defekter som ligger bakom FASD. I slutändan visar vi i detta protokoll att den modulära installationen och konstruktionen av transgena konstruktioner i hög grad kommer att hjälpa zebrafiskbaserad FASD-forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene Tol2 toolbox</td>
			<td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided directly by the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>2486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Dissecting Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lawsone Lab Donor Plasmid Prep</td>
			<td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II Plus Enzyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12538200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipette holder</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MIMPH-M-PIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 0.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet</td>
			<td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4758-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup .22 &#181;m vacuum filtration system&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU11RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2 Wiki Page</td>
			<td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipetter Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>i34</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach

Fetala alkoholspektrumstörningar (FASD) kännetecknas av en mycket varierande uppsättning strukturella defekter och kognitiva funktionsnedsättningar som uppstår på grund av prenatal etanolexponering. På grund av FASD: s komplexa patologi har djurmodeller visat sig vara avgörande för vår nuvarande förståelse av etanolinducerade utvecklingsdefekter. Zebrafisk har visat sig vara en kraftfull modell för att undersöka etanolinducerade utvecklingsdefekter på grund av den höga graden av bevarande av både genetik och utveckling mellan zebrafisk och människor. Som modellsystem har zebrafiskar många attribut som gör dem idealiska för utvecklingsstudier, inklusive ett stort antal externt befruktade embryon som är genetiskt lätthanterliga och genomskinliga. Detta gör det möjligt för forskare att exakt kontrollera tidpunkten och doseringen av etanolexponering i flera genetiska sammanhang. Ett viktigt genetiskt verktyg som finns i zebrafisk är transgenes. Att generera transgena konstruktioner och etablera transgena linjer kan dock vara komplicerat och svårt. För att ta itu med detta problem har zebrafiskforskare etablerat det transposonbaserade Tol2-transgenessystemet. Detta modulära system använder en multisite Gateway-kloningsmetod för snabb montering av kompletta Tol2-transposonbaserade transgena konstruktioner. Här beskriver vi den flexibla verktygslådan för Tol2-systemet och ett protokoll för att generera transgena konstruktioner redo för zebrafisktransgenes och deras användning i etanolstudier.

För att generera de transgena konstruktionerna använde vi Tol2-transgenessystemet. Tre ingångsvektorer, inklusive p5E, som håller genpromotorn / förstärkareelementen, pME, som håller genen som ska uttryckas av promotorn / förstärkareelementen, och p3E som åtminstone håller polyA-svansen, användes för att generera den transgena konstruktionen via multisite gateway LR-kloning. Destinationsvektorn, pDest, tillhandahåller Tol2-upprepningarna för genomisk insättning av den transgena konstruktionen i z...

Watch this Scientific Journal Video about The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach at JoVE.com

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Detta arbete beskriver ett protokoll för det modulära Tol2-transgenessystemet, en gateway-baserad kloningsmetod för att skapa och injicera transgena konstruktioner i zebrafiskembryon.

Zebrafiskens Tol2-system: En modulär och flexibel gateway-baserad transgenesmetod

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Transgena zebrafiskar har visat sig vara avgörande för vår förståelse av embryoutveckling. Tol2-systemet är ett mångsidigt verktyg som gör det möjligt för forskare att snabbt och systematiskt generera flera transgena zebrafiskar för FASD-studier. Den modulära designen och lättheten att generera nya kitkomponenter gör Tol2-systemet till ett mångsidigt verktyg för att generera ny transgenik utan att behöva designa om några komponenter i satsen.Mitt råd till forskare som utför denna teknik för första gången är att göra flera provkörningar för att träna på precisionen att generera och injicera transgena konstruktioner. För att börja, linjärisera Tol2-kitplasmiden innehållande transposas med ett nought one-restriktionsendonukleas genom att kombinera 10 mikroliter transposasplasmid, 1,5 mikroliter restriktionsendonukleasreaktionsbuffert och 0,3 mikroliter nought one-endonukleas i ett 500 mikroliter mikrocentrifugrör. Fyll reaktionen upp till 20 mikroliter med RNAse-fritt vatten.Blanda och smält vid 37 grader Celsius över natten. Nästa dag, stoppa matsmältningen genom att tillsätta en mikroliter 0,5 molar EDTA, två mikroliter fem molar ammoniumacetat och 80 mikroliter 100% etanol till reaktionsblandningen. Blanda och kyla vid minus 20 grader Celsius över natten.Följande dag, centrifugera och aspirera supernatanten innan DNA-pelleten återsuspenderas i RNAse-fritt vatten. Bestäm sedan den linjära plasmidkoncentrationen i nanogram per mikroliter på en fluorometer genom att köra två mikroliter av provet. Ställ in SP6 mRNA-produktionen genom att kombinera 10 mikroliter 2X NTP / CAP, två mikroliter 10X reaktionsbuffert, 0,1 till ett mikrogram linjär DNA-mall i två mikroliter SP6-enzymblandning i ett 500 mikroliterrör.Fyll reaktionen upp till 20 mikroliter med RNAse-fritt vatten och blanda innan du inkuberar vid 37 grader Celsius. Efter två timmar, tillsätt en mikroliter DNAse, blanda väl och inkubera i ytterligare 15 minuter. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 30 mikroliter litiumkloridutfällningslösning.Blanda och kyla vid minus 20 grader Celsius över natten. Nästa dag, centrifugera lösningen för att pellet mRNA och aspirera supernatanten innan du tvättar pelleten med en milliliter 80% etanol. Lufttorka pelleten och resuspendera den i 20 mikroliter RNAse-fritt vatten.Bestäm mRNA-koncentrationen med hjälp av en fluorometer, alikvot sedan 100 nanogram mRNA per rör för engångsbruk och lagra vid minus 80 grader Celsius. För att utföra reaktionen, samla 10 femtomol vardera av P5E, PME och P3E och 20 femtomol av destinationsvektorn PDEST. Identifiera storleken på alla fyra vektorer och baspar från plasmidkällan.Efter att ha bestämt koncentrationen av alla fyra vektorerna, med användning av DNA-vikten som 660 gram per mol och plasmidstorlek och baspar, beräkna det totala nanogram plasmid som behövs för att nå antingen 10 femtomol för ingångsvektorer eller 20 femtomol för destinationsvektor. Generera sedan konstruktionen sox17: EGFP-CAAX med hjälp av komponenterna som beskrivs i manuskriptet. Använd plasmidkoncentrationen, beräkna de totala mikroliter av varje plasmid som behövs för att nå antingen 10 femtomol eller 20 femtomol och dela sedan detta med två för användning i de fem mikroliter halva LR-reaktionerna.Generera 10 femtomol av P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) och 20 femtomol av destinationsvektorn. Ställ in fem mikroliter halv LR-reaktion genom att kombinera volymerna av P5E, PME, P3E och PDEST i ett 500 mikroliterrör. Tillsätt sedan sterilt vatten för att göra volymen fyra mikroliter.Vortex LR-enzymet blandas två gånger i en minut vardera innan du tillsätter en mikroliter till reaktionen och blanda noggrant innan du inkuberar vid 25 grader Celsius. Följande dag, stoppa LR-reaktionen genom att tillsätta 0,5 mikroliter proteinas K.Inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter och svalna sedan till rumstemperatur. Omvandla sedan tre till fyra mikroliter av plasmiden till tinade kemiskt kompetenta celler genom att tillsätta plasmiden och låta cellerna sitta på is i 25 till 30 minuter.Värmechocka sedan cellerna i ett 42 grader Celsius vattenbad i 30 sekunder. Efter värmechocken tillsätt 250 mikroliter antibiotikafria rika flytande medier till cellerna och inkubera med skakning vid 37 grader Celsius i 1,5 timmar. Sprid 300 mikroliter bakteriell suspension på en ampicillin Luria-Bertani platta och inkubera över natten.Följande dag, screena kolonierna för närvaron av två fenotyper: klar och ogenomskinlig. Välj de klara kolonierna en i taget, inokulera den flytande kulturen och skaka vid 37 grader Celsius över natten. Kombinera 150 nanogram plasmid, 100 nanogram transposas mRNA och 2% fenolrött på is.Tillsätt sedan RNA-fritt vatten för att göra volymen tre mikroliter. Överför ett cellstegsembryo med överföringspipetter till injektionsplattan fylld med EM som helt täcker agaren och tryck sedan försiktigt in cirka 50 till 75 embryon per spår på injektionsplattan. Tillsätt mRNA-plasmidfenolrödblandningen till den öppna änden av en kapillärinjektionsnål.Placera kapillärnålen i ankaret på injektionsriggen och slå på insprutningsriggen. Sänk ner nålen i injektionsplattan och bryt spetsen med pincett så att endast en liten mängd blandning kan pumpas ut av injektionsriggen. Injicera embryona med en tre nanoliter bolus av mRNA plasmid fenolröd blandning i embryots cellkropp.När du är klar, ta bort embryona från injektionsplattan genom att försiktigt poppa dem ur spåret och överför pipettering dem till en 100 millimeter petriskål med färsk EM. Inkubera vid 28,5 grader Celsius. Välj lämpligt utvecklingsstadium för fluorescerande transgenuttryck och skärm under ett fluorescerande dissekeringsmikroskop. Screena för icke-fluorescerande transgener genom screening för fluorescerande transgena markörer såsom GFP som drivs av den hjärtspecifika promotorn för genen Cmlc2.När embryon som är positiva för transgen insättning utvecklas till vuxna och når avelsåldern, screena dem individuellt för överföring av könsceller och transgen uttrycksfullhet genom att avla dem till zebrafisk av vildtyp. Exempel på bakteriekolonier erhållna från omvandlingen av LR-rekombinationen visas. Klara kolonier innehöll en korrekt LR-rekombinationsprodukt mer än 85% av tiden, medan ogenomskinliga kolonier aldrig innehöll en korrekt rekombinationsprodukt.Diagnostisk nedbrytning av de tre kolonierna från omvandlingen av LR-rekombinationsprodukterna visade att den enda ogenomskinliga kolonin inte innehöll någon plasmid, medan de två klara kolonierna innehöll ett enda band vid 9 544 baspar. Transposas mRNA vid 1, 950 baspar visas här. Mosaikendoderm EGFP-CAAX-uttryck observerades hos 75% av de injicerade embryona.Transgent marköruttryck av Cmlc2 EGFP i utvecklingshjärtat observerades 24 timmar efter befruktning. Vuxna zebrafiskar hade könscellsöverföring av sox17: EGFP-CAAX-genererade fluorescerande embryon med endodermen helt märkt med EGFP-CAAX. Både den främre-bakre längden på endodermen och den dorsala ventrala längden på varje påse från påsar ett till fem mättes i kontroll- och etanolbehandlade BMP-muterade embryon av vildtyp.Den totala längden av endoderm påverkades inte av genotyp eller behandling. Påsar ett och tre visade dock signifikanta ökningar i påslängd mellan obehandlade och etanolbehandlade embryon av vildtyp, men signifikanta längdminskningar mellan obehandlade och etanolbehandlade BMP-mutanter. Påse två visade signifikanta ökningar i påsstorlek mellan de obehandlade och etanolbehandlade vildtyps- respektive BMP-mutantgrupperna.När du försöker med denna procedur är det viktigt att vara exakt vid pipettering och utspädning av Tol2-systemet, samt att träffa cellkroppen under embryoinjektion.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Live avbildning av medfödda immun och preneoplastiska Cell interaktioner Använda en Inducerbar Gal4 / UAS Expression System i Larvzebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic tillvägagångssätt för att bedöma Bildande av neurala anslutningar i en samodlingssystemet

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Mosaic Zebrafish genmodifiering för Funktionell Genomic analys av kandidat Kooperativa gener i tumör Patogenes

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Användning av Teton system att studera molekylära mekanismer Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginat inkapsling av pluripotenta stamceller med hjälp av en Co-axial munstycke

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantation i zebrafisk embryot

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Spåra celler i GFP-transgen zebrafisk Använda Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Mikroinjektion för genmodifiering och Genome redigering i Threespine sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Exakt cellablationsmetod för modellering av akut njurskada vid utveckling av sebrafisk

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...