Name: the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach at JoVE.com

Bu makalede sunulan araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri / Ulusal Alkol Kötüye Kullanımı Enstitüsü (NIH / NIAAA) R00AA023560'tan C.B.L.'ye bir hibe ile desteklenmiştir.

Bu prosedürde kullanılan tüm zebra balığı embriyoları, belirlenmiş IACUC protokolleri12'ye uygun olarak yetiştirildi ve yetiştirildi. Bu protokoller Louisville Üniversitesi tarafından onaylandı.
NOT: Bu çalışmada vahşi tip zebra balığı suşu AB ve bmp4st72;smad5b1100 çift mutant hattı kullanılmıştır. Bu işlemde kullanılan suyun tamamı steril ters ozmoz suyuydu. Konfokal görüntüler lazer taramalı konfokal mi...

<ol>
	<li>Denny, L., Coles, S., Blitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+syndrome+and+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders.</a> American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).</li><li>Popova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comorbidity+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).</li><li>Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+spectrum+disorders:+Characteristics,+complications,+and+treatment.">Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment.</a> Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).</li><li>Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+presentation,+diagnosis,+and+management+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder.</a> The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).</li><li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors.">A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).</li><li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+gene-alcohol+interactions.">Animal models of gene-alcohol interactions.</a> Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).</li><li>Fernandes, Y., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Genesis. 59 (11), 23460 (2021).</li><li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis:+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li><li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research.">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+A+multisite+gateway-based+construction+kit+forTol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Don, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tol2+gateway-compatible+toolbox+for+the+study+of+the+nervous+system+and+neurodegenerative+disease.">A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease.</a> Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Protocols. UMass Chan Medical School Available from: <a target="_blank" href="https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols">https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols</a> (2017)</li><li>Mosimann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+gateway+calculations:+Excel+spreadsheet.">Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet.</a> protocols.io. , (2022).</li><li>Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-endodermal+interactions+are+required+for+pancreatic+&#946;+cell+induction.">Intra-endodermal interactions are required for pancreatic &#946; cell induction.</a> Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).</li><li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish.">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li><li>Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+(Danio+rerio)+as+an+emerging+model+system+in+ecotoxicology+and+toxicology:+Historical+review,+recent+advances,+and+trends.">Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends.</a> Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).</li><li>Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+the+toxicant+screening+model:+Transgenic+and+omics+approaches.">Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches.</a> Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).</li><li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li><li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+transgenesis,+gene+trapping,+enhancer+trapping,+and+Gal4-UAS+system.">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li></ol>

Zebra balığı, etanol maruziyetinin gelişim ve hastalık durumları üzerindeki etkisini incelemek için idealdir 7,8. Zebra balığı, çok sayıda yarı saydam, harici olarak döllenmiş, genetik olarak izlenebilir embriyolar üretir, bu da birden fazla çevresel bağlamda aynı anda birkaç transgen etiketli doku ve hücre tipinin canlı görüntülenmesine izin verir 19,20. Bu güçlü yönler, ins...

Prenatal etanol maruziyeti, fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD) olarak adlandırılan yapısal eksikliklerin ve bilişsel bozuklukların sürekliliğine yol açar1,2,3,4. Birden fazla faktör arasındaki karmaşık ilişkiler, insanlarda FASD'nin etiyolojisini incelemeyi ve anlamayı zorlaştırmaktadır. Bu zorluğu çözmek için çok çeşitli hayvan modelleri kullanılmıştır. Bu modellerde bulunan biyolojik ve deneysel araçlar, etanol teratojenitesinin mekanik temeli hakkındaki anlayışımızı geliştirmede çok önemli olduğunu kanıtlamıştır ve bu model sistemlerinden elde edilen sonuçlar, insan etanol çalışmalarında bulunanlarla oldukça tutarlıdır 5,6. Bunlar arasında, zebra balığı, kısmen dış döllenmeleri, yüksek doğurganlıkları, genetik izlenebilirlikleri ve yarı saydam embriyoları nedeniyle etanol teratogenezi 7,8'i incelemek için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bu güçlü yönler, zebra balığını, transgenik zebra balığı hatlarını kullanarak FASD'nin gerçek zamanlı canlı görüntüleme çalışmaları için ideal hale getirmek için bir araya gelir.
Transgenik zebra balığı, embriyonik gelişimin birçok yönünü incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır9. Bununla birlikte, transgenik yapılar ve müteakip transgenik çizgiler oluşturmak son derece zor olabilir. Standart bir transgen, transgeni ve bir poli A sinyalini veya "kuyruğunu" sürmek için aktif bir promotör eleman gerektirir, bunların hepsi genel vektör bakımı için kararlı bir bakteriyel vektördedir. Çok bileşenli bir transgenik yapının geleneksel üretimi, çok zaman alıcı alt klonlama adımları gerektirir10. Gibson montajı gibi PCR tabanlı yaklaşımlar, alt klonlama ile ilgili bazı sorunları atlatabilir. Bununla birlikte, her benzersiz transgenik yapı10'un üretimi için benzersiz astarlar tasarlanmalı ve test edilmelidir. Transgen yapımının ötesinde, genomik entegrasyon, germline iletimi ve uygun transgen entegrasyonu için tarama da zor olmuştur. Burada, transpozon tabanlı Tol2 transgenez sistemini (Tol2Kit) kullanmak için bir protokol açıklıyoruz10,11. Bu modüler sistem, sürekli genişleyen "giriş" ve "hedef" vektörleri kütüphanesinden hızlı bir şekilde çoklu transgenik yapılar oluşturmak için çok bölgeli Ağ Geçidi klonlamasını kullanır. Entegre Tol2 transpoze edilebilir elementler, transgenez oranını büyük ölçüde artırarak, çoklu transgenlerin hızlı bir şekilde oluşturulmasına ve genomik entegrasyonuna izin verir. Bu sistemi kullanarak, bir endoderm transgenik zebra balığı hattının oluşturulmasının, FASD'nin altında yatan dokuya özgü yapısal kusurları incelemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Nihayetinde, bu protokolde, modüler kurulumun ve transgenik yapıların inşasının zebra balığı tabanlı FASD araştırmalarına büyük ölçüde yardımcı olacağını gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene Tol2 toolbox</td>
			<td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided directly by the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>2486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Dissecting Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lawsone Lab Donor Plasmid Prep</td>
			<td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II Plus Enzyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12538200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipette holder</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MIMPH-M-PIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 0.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet</td>
			<td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4758-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup .22 &#181;m vacuum filtration system&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU11RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2 Wiki Page</td>
			<td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipetter Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>i34</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach

Fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD), prenatal etanol maruziyetine bağlı olarak ortaya çıkan oldukça değişken yapısal bozukluklar ve bilişsel bozukluklar ile karakterizedir. FASD'nin karmaşık patolojisi nedeniyle, hayvan modellerinin etanol kaynaklı gelişimsel kusurlar hakkındaki mevcut anlayışımız için kritik olduğu kanıtlanmıştır. Zebra balığının, zebra balığı ve insanlar arasındaki hem genetiğin hem de gelişimin yüksek derecede korunması nedeniyle etanol kaynaklı gelişimsel kusurları incelemek için güçlü bir model olduğu kanıtlanmıştır. Model bir sistem olarak, zebra balığı, genetik olarak izlenebilir ve yarı saydam olan çok sayıda harici olarak döllenmiş embriyo da dahil olmak üzere, onları gelişimsel çalışmalar için ideal kılan birçok özelliğe sahiptir. Bu, araştırmacıların çoklu genetik bağlamlarda etanol maruziyetinin zamanlamasını ve dozajını hassas bir şekilde kontrol etmelerini sağlar. Zebra balığında bulunan önemli bir genetik araç transgenezdir. Bununla birlikte, transgenik yapılar oluşturmak ve transgenik çizgiler oluşturmak karmaşık ve zor olabilir. Bu sorunu ele almak için, zebra balığı araştırmacıları transpozon tabanlı Tol2 transgenez sistemini kurdular. Bu modüler sistem, eksiksiz Tol2 transpozon tabanlı transgenik yapıların hızlı montajı için çok bölgeli bir Ağ Geçidi klonlama yaklaşımı kullanır. Burada, esnek Tol2 sistem araç kutusunu ve zebra balığı transgenezi için hazır transgenik yapılar oluşturmak için bir protokolü ve bunların etanol çalışmalarında kullanımını açıklıyoruz.

Transgenik yapıları oluşturmak için Tol2 transgenez sistemini kullandık. Gen promotör/arttırıcı elementleri tutan p5E, promotör/arttırıcı elementler tarafından ifade edilecek geni tutan pME ve en azından poliA kuyruğunu tutan p3E dahil olmak üzere üç giriş vektörü, çok bölgeli ağ geçidi LR klonlaması yoluyla transgenik yapıyı oluşturmak için kullanıldı. Hedef vektör pDest, zebra balığı embriyolarında transgenik yapının genomik yerleştirilmesi için Tol2 tekrarlarını sa?...

Watch this Scientific Journal Video about The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach at JoVE.com

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Transgenik zebra balığı, embriyo gelişimini anlamamız için kritik öneme sahip olduğunu kanıtlamıştır. Tol2 sistemi, araştırmacıların FASD çalışmaları için hızlı ve sistematik olarak birden fazla transgenik zebra balığı üretmelerini sağlayan çok yönlü bir araçtır. Modüler tasarım ve yeni kit bileşenleri üretme kolaylığı, Tol2 sistemini, kitin herhangi bir bileşenini yeniden tasarlamak zorunda kalmadan yeni transgenikler üretmek için çok yönlü bir araç haline getirir.Bu tekniği ilk kez uygulayan araştırmacılara tavsiyem, transgenik yapıların üretilmesi ve enjekte edilmesinin hassasiyeti konusunda eğitim almak için birkaç deneme çalışması yapmalarıdır. Başlamak için, transpozaz içeren Tol2 kiti plazmidini, 10 mikrolitre transpozaz plazmidi, 1.5 mikrolitre kısıtlama endonükleaz reaksiyon tamponu ve 0.3 mikrolitre sıfır bir endonükleazı 500 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek bir sıfır kısıtlama endonükleazı ile doğrusallaştırın. 20 mikrolitreye kadar reaksiyonu RNAse içermeyen suyla doldurun.Gece boyunca 37 santigrat derecede karıştırın ve sindirin. Ertesi gün, reaksiyon karışımına bir mikrolitre 0.5 molar EDTA, iki mikrolitre beş molar amonyum asetat ve 80 mikrolitre% 100 etanol ekleyerek sindirimi durdurun. Gece boyunca eksi 20 santigrat derecede karıştırın ve soğutun.Ertesi gün, DNA peletini RNAse içermeyen suda yeniden askıya almadan önce süpernatantı santrifüj edin ve aspire edin. Daha sonra, numunenin iki mikrolitresini çalıştırarak bir florometre üzerinde mikrolitre başına nanogram cinsinden doğrusal plazmid konsantrasyonunu belirleyin. SP6 mRNA üretimini, 10 mikrolitre 2X NTP / CAP, iki mikrolitre 10X reaksiyon tamponu, 0.1 ila bir mikrogram doğrusal DNA şablonunu iki mikrolitre SP6 enzim karışımında 500 mikrolitrelik bir tüpte birleştirerek ayarlayın.20 mikrolitreye kadar reaksiyonu RNAse içermeyen suyla doldurun ve 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce karıştırın. İki saat sonra, bir mikrolitre DNAse ekleyin, iyice karıştırın ve 15 dakika daha inkübe edin. 30 mikrolitre lityum klorür çökeltme çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun.Gece boyunca eksi 20 santigrat derecede karıştırın ve soğutun. Ertesi gün, mRNA'yı pelet haline getirmek için çözeltiyi santrifüj edin ve peleti bir mililitre% 80 etanol ile yıkamadan önce süpernatantı aspire edin. Peletin havayla kurutulması ve 20 mikrolitre RNAse içermeyen suda tekrar askıya alınması.Bir florometre kullanarak mRNA konsantrasyonunu belirleyin, ardından tek kullanım için tüp başına 100 nanogram mRNA'yı aliquot edin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Reaksiyonu gerçekleştirmek için, P5E, PME ve P3E'nin her biri 10 femtomol ve hedef vektör PDEST'in 20 femtomolünü toplayın. Plazmid kaynağından dört vektörün ve baz çiftinin boyutunu tanımlayın.Dört vektörün konsantrasyonunu belirledikten sonra, DNA'nın ağırlığını mol başına 660 gram ve plazmid boyutu ve baz çiftleri olarak kullanarak, giriş vektörleri için 10 femtomol'e veya hedef vektör için 20 femtomol'e ulaşmak için gereken toplam plazmid nanogramlarını hesaplayın. Ardından, makalede açıklanan bileşenleri kullanarak sox17:EGFP-CAAX yapısını oluşturun. Plazmid konsantrasyonunu kullanarak, 10 femtomol veya 20 femtoole ulaşmak için gereken her plazmidin toplam mikrolitresini hesaplayın ve ardından beş mikrolitre yarım LR reaksiyonunda kullanılmak üzere bunu ikiye bölün.10 femtomol P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) ve 20 femtomol hedef vektör üretin. P5E, PME, P3E ve PDEST hacimlerini 500 mikrolitrelik bir tüpte birleştirerek beş mikrolitre yarım LR reaksiyonu ayarlayın. Daha sonra hacmi dört mikrolitre yapmak için steril su ekleyin.LR enzimini vorteks, reaksiyona bir mikrolitre eklemeden önce her biri bir dakika boyunca iki kez karıştırın ve 25 santigrat derecede inkübe etmeden önce iyice karıştırın. Ertesi gün, 0.5 mikrolitre proteinaz K.Incubate'de 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe ederek LR reaksiyonunu durdurun ve ardından oda sıcaklığına soğutun. Daha sonra, plazmidin üç ila dört mikrolitresini, plazmidi ekleyerek ve hücrelerin 25 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin vererek çözülmüş kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün.Daha sonra ısı, hücreleri 42 santigrat derecelik bir su banyosunda 30 saniye boyunca şoklar. Isı şokundan sonra, hücrelere 250 mikrolitre antibiyotiksiz zengin sıvı ortam ekleyin ve 1,5 saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Bir ampisilin Luria-Bertani plakasına 300 mikrolitre bakteri süspansiyonu yayın ve gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, kolonileri iki fenotipin varlığı açısından tarayın: açık ve opak. Berrak kolonileri birer birer seçin, sıvı kültürü aşılayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede sallayın. 150 nanogram plazmid, 100 nanogram transpozaz mRNA ve% 2 fenol kırmızısını buz üzerinde birleştirin.Daha sonra hacmi üç mikrolitre yapmak için RNA'sız su ekleyin. Transfer pipetleri kullanarak bir hücre aşaması embriyosunu, agar'ı tamamen kaplayan EM ile doldurulmuş enjeksiyon plakasına aktarın ve ardından enjeksiyon plakasının yuvası başına yaklaşık 50 ila 75 embriyoyu hafifçe bastırın. mRNA plazmid fenol kırmızı karışımını kılcal enjeksiyon iğnesinin açık ucuna ekleyin.Kılcal iğneyi enjeksiyon teçhizatı armatürüne yerleştirin ve enjeksiyon makinesini açın. İğneyi enjeksiyon plakasına indirin ve enjeksiyon teçhizatı tarafından sadece az miktarda karışımın pompalanmasına izin vermek için forseps kullanarak ucu kırın. Embriyolara, mRNA plazmid fenol kırmızı karışımının üç nanolitrelik bir bolusu ile embriyonun hücre gövdesine enjekte edin.İşiniz bittiğinde, embriyoları yavaşça yuvadan dışarı atarak enjeksiyon plakasından çıkarın ve pipetleyerek taze EM ile 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Floresan transgen ekspresyonu için uygun gelişim aşamasını seçin ve floresan diseksiyon mikroskobu altında tarayın. Cmlc2 geni için kardiyak spesifik promotör tarafından tahrik edilen GFP gibi floresan transgenik belirteçleri tarayarak floresan olmayan transgenleri tarayın.Transgenik yerleştirme için pozitif embriyolar yetişkinlere geliştiğinde ve üreme yaşına ulaştığında, onları vahşi tip zebra balıklarına yetiştirerek germline iletimi ve transgen ekspresyonu için ayrı ayrı tarayın. LR rekombinasyonunun dönüşümünden elde edilen örnek bakteri kolonileri gösterilmiştir. Berrak koloniler zamanın %85'inden fazlasında doğru bir LR rekombinasyon ürünü içerirken, opak koloniler hiçbir zaman doğru bir rekombinasyon ürünü içermemiştir.LR rekombinasyon ürünlerinin dönüşümünden üç koloninin tanısal sindirimi, tek opak koloninin herhangi bir plazmid içermediğini, iki berrak koloninin ise 9.544 baz çiftinde tek bir bant içerdiğini gösterdi. Transpozaz mRNA 1.950 baz çiftinde burada gösterilmiştir. Enjekte edilen embriyoların %75'inde mozaik endoderm EGFP-CAAX ekspresyonu gözlendi.Gelişmekte olan kalpte Cmlc2 EGFP'nin transgenik belirteç ekspresyonu döllenmeden 24 saat sonra gözlendi. Yetişkin zebra balığı, endoderm EGFP-CAAX ile tamamen etiketlenmiş sox17: EGFP-CAAX tarafından üretilen floresan embriyoların germline iletimine sahipti. Kontrol ve etanol ile tedavi edilen vahşi tip BMP mutant embriyolarında endodermin hem anterior-posterior uzunluğu hem de her bir poşetin bir ila beş poşetten dorsal-ventral uzunluğu ölçüldü.Endodermin toplam uzunluğu genotip veya tedaviden etkilenmedi. Bununla birlikte, bir ve üçüncü torbalar, tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip embriyolar arasındaki kese uzunluğunda önemli artışlar gösterdi, ancak tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş BMP mutantları arasındaki uzunlukta önemli azalmalar gösterdi. Poşet iki, sırasıyla işlenmemiş ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip ve BMP mutant grupları arasında kese boyutunda önemli artışlar gösterdi.Bu prosedürü denerken, Tol2 sisteminin pipetlenmesi ve seyreltilmesinde ve embriyo enjeksiyonu sırasında hücre gövdesine vurulmasında hassas olmak çok önemlidir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Gelişim Biyolojisi

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...