Cultura de Longa Duração e Monitoramento de Caenorhabditis elegans Isolados em Meio Sólido em Dispositivos Multipoços

Quando estamos estudando o envelhecimento e os elegans marinhos, normalmente estamos acompanhando uma população de animais ao longo do tempo. Isso nos dá um vislumbre do que esse processo que você está estudando está fazendo na população em cada ponto de tempo, mas não diz como o processo está mudando em animais individuais ao longo do tempo. Esses ambientes de cultura animal única nos permitem acompanhar mudanças dinâmicas em processos moleculares e processos fisiológicos em animais individuais ao longo do tempo para centenas de animais em paralelo.

Descobrimos que há duas coisas principais que podem realmente impactar a qualidade desses sistemas de cultura multipoço. Uma é sobre ou abaixo da secagem dos poços e a segunda é a contaminação. E tentamos observar ao longo do protocolo etapas específicas onde você pode tentar mitigar esses problemas.

Quem demonstrará o protocolo hoje será Emily Gardea. Ela é técnica no meu laboratório e tem feito muito trabalho para otimizar esse protocolo. Depois de preparar todos os reagentes, misture 60 gramas de base PDMS e seis gramas de agente de cura por molde em um barco grande descartável usando uma espátula descartável.

Coloque a mistura de PDMS em uma câmara de vácuo por 30 minutos a menos 0,08 Mega Pascal para remover bolhas. Despeje e preencha a mistura de PDMS em cada molde impresso em 3D. Coloque o molde preenchido e qualquer mistura extra de PDMS na câmara de vácuo por 25 minutos a menos 0,08 Mega Pascal.

Retire o molde preenchido da câmara de vácuo e estoure as bolhas restantes com uma espátula descartável. Começando com uma borda, abaixe lentamente uma folha de acrílico plana sobre o molde preenchido com PDMS. Se ocorrer formação de bolhas, proceda conforme descrito no manuscrito.

Coloque um peso de 2,5 quilos sobre o acrílico e coloque as formas pesadas no forno. Deixe-os curar a 55 graus Celsius durante a noite. Ao final da incubação, retire os pesos e as formas do forno.

Em seguida, trabalhe uma lâmina de barbear entre o acrílico e o PDMS curado Para quebrar o selo Usando uma navalha ou uma espátula de metal, solte cuidadosamente as laterais do PDMS curado e retire-as do molde. Embrulhe o dispositivo PDMS em papel alumínio. Selá-lo com fita autoclave e esterilizar por autoclave em ciclo seco por pelo menos 15 minutos a 121 graus Celsius e pressão de 15 libras por polegada quadrada de manômetro.

Para preparar o dispositivo multipoço, pré-aqueça uma incubadora de banho de contas secas a 90 graus Celsius. Desembrulhe um dispositivo multipoço autoclavado e corte um pequeno entalhe no canto superior direito do dispositivo. Coloque até três dispositivos desembrulhados no limpador de plasma com os orifícios virados para cima e execute o limpador de plasma.

Esterilize uma bandeja de poliestireno de poço único por dispositivo, borrifando o interior da bandeja com etanol 70% e limpando-a com um lenço de limpeza. Retire cada dispositivo do limpador de plasma com uma mão enluvada e coloque-o em uma bandeja limpa. Em seguida, coloque uma bacia de pipeta descartável de 25 mililitros na incubadora de banho de contas pré-aquecida a 90 graus Celsius.

Pegue um tubo de pré-mistura LMNGM solidificado por dispositivo a ser preenchido e coloque-o em um copo de vidro de 200 mililitros. Retire a tampa e o Parafilm e o micro-ondas até que o meio derreta o suficiente para despejar. Despeje a pré-mistura LMNGM derretida em outro copo estéril de 200 mililitros.

Vários tubos de ensaio podem ser combinados neste copo se mais de um dispositivo for preenchido ao mesmo tempo. Leve à pré-mistura LMNGM no micro-ondas por mais 20 segundos. Se a pré-mistura começar a ferver, pare o micro-ondas e deixe assentar.

Retire a pré-mistura LMNGM derretida do micro-ondas e arrefeça a 60 graus Celsius. Adicione os ingredientes LMNGM restantes à mistura de pré-mistura e despeje o LMNGM fundido na bacia de 25 mililitros no banho de contas. Encha os poços do dispositivo usando uma pipeta repetidora multicanal de 200 microlitros.

Ajuste o repetidor para dispensar alíquotas de 14 microlitros e montar cinco ponteiras de pipeta. Carregue as pontas com LMNGM fundido e distribua os primeiros 14 microlitros de volta na bacia contendo LMNGM. Movendo-se rapidamente, mas cuidadosamente, distribua 14 microlitros nos poços internos do dispositivo e distribua o LMNGM restante de volta para a bacia, pois a alíquota final é tipicamente inferior a 14 microlitros.

Em seguida, ajuste o repetidor para dispensar alíquotas de 15 microlitros e preencher o anel mais externo dos poços. Usando uma pipeta de 200 microlitros, distribua 200 microlitros de solução de sulfato de cobre no fosso do dispositivo em cada canto. Evite encher demais o fosso e certifique-se de que o sulfato de cobre não toque na superfície superior dos poços.

Se o sulfato de cobre não fluir facilmente através de todo o fosso, use uma picareta de fio de platina curta para ajudar a quebrar a tensão e arrastar o sulfato de cobre através do fosso. Depois que o sulfato de cobre fluir através de todo o fosso, remova o máximo de sulfato de cobre possível usando uma pipeta de 200 microlitros ou aspiração com vácuo. Usando uma garrafa de squeeze, adicione os cristais de água nos espaços entre o dispositivo e as paredes da bandeja.

Feche a tampa da bandeja e envolva os quatro lados com um pedaço de Parafilm. Adicione mais duas peças de Parafilm para selar completamente a placa. Usando uma pipeta repetidora, identifique cada poço com cinco microlitros de bactérias concentradas.

Evite o contato direto com a superfície LMNGM. Seque os dispositivos usando uma caixa de secagem personalizada que pode ser construída a um custo mínimo usando ventiladores de gabinete de computador e filtros HEPA. Sob um escopo de dissecação, inspecione os poços para garantir que todos os poços tenham secado com sucesso.

Usando uma picareta de platina, transfira os animais das placas de minhoca preparadas e adicione uma minhoca por poço. Adicione uma gota de solução de detergente preparada ao interior da tampa da bandeja e esfregue com um lenço de limpeza até que a solução de detergente tenha secado. Embrulhe a bandeja com três pedaços de Parafilm conforme descrito no manuscrito.

A extensão da vida útil do daf-2(RNAi) é bloqueada pela mutação nula daf-16. O tempo de saúde também diminuiu na presença de daf-2(RNAi)A média contínua de três dias de atividade ao longo da vida é reduzida pelo mutante daf-16 e daf-2(RNAi)A variação na expectativa de vida e no tempo de saúde entre animais individuais comparados em termos absolutos ou como uma fração da expectativa de vida total é mostrada. A atividade cumulativa ao longo da vida útil para animais individuais correlaciona-se melhor com a expectativa de vida do que a atividade para animais individuais em qualquer dia específico ao longo da vida.

É importante encher os poços e adicionar as minhocas o mais rápido possível. Caso contrário, os poços podem secar e os vermes não sobreviverão. Este sistema é compatível com imagens automatizadas que podem ser usadas para coletar dados de alto rendimento, como tempo de vida, atividade e tamanho ou forma do corpo.