Name: screening sperm for the rapid isolation of germline edits in zebrafish
Uploaded: 2023-02-10T12:10:00
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Vorremmo ringraziare Anna Hindes della Washington University School of Medicine per i suoi sforzi iniziali nell'ottenere DNA genomico spermatico di buona qualità utilizzando il metodo hot shot. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health under Award (R01AR072009 to R.S.G.).

Questo studio è stato condotto in linea con le linee guida della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dall'Università del Texas presso il Comitato per la cura e l'uso degli animali di Austin (AUP-2021-00254).
1. Progettazione dello sgRNA per la mutagenesi di CRISPR
<ol><li>Ottenere la sequenza di esoni contenente i loci mirati.</li>
	<li>Progettare un RNA guida sintetico (sgRNA) con un si...

<ol>
	<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li><li>Troutwine, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reissner+fiber+is+highly+dynamic+in+vivo+and+controls+morphogenesis+of+the+spine.">The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine.</a> Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).</li><li>Xu, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems:+Overview,+innovations+and+applications+in+human+disease+research+and+gene+therapy.">CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).</li><li>Creaser, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+technic+of+handling+the+zebrafish+(Brachydanio+rerio)+for+the+production+of+eggs+which+are+favorable+for+embryological+research+and+are+available+at+any+specified+time+throughout+the+year.">The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year.</a> Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).</li><li>Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservatin+and+in+vitro+fertilization+at+the+zebrafish+international+resource+center.">Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).</li><li>Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axonemal+dynein+heavy+chain+10+gene+is+essential+for+monocilia+motility+and+spine+alignment+in+zebrafish.">The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish.</a> Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).</li><li>Gray, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+screen+for+mutations+affecting+spine+development+in+zebrafish.">Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).</li><li>Brocal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+CRISPR/Cas9-induced+insertions/deletions+by+direct+germline+screening+in+zebrafish.">Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish.</a> BMC Genomics. 17, 259 (2016).</li><li>Davis, M. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApE,+A+Plasmid+Editor:+A+freely+available+DNA+manipulation+and+visualization+program.">ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program.</a> Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).</li><li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v3:+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing.">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li><li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+Peak+Parser:+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products.">Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-TOM:+A+platform+for+high-throughput+tracking+of+mutations+induced+by+CRISPR/Cas+systems.">Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems.</a> Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+identification+of+CRISPR/Cas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio.">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Draper, B. W., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+zebrafish+sperm+cryopreservation+and+in+vitro+fertilization.">A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).</li><li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants.">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li></ol>

Questo protocollo descrive un metodo per caratterizzare rapidamente le modifiche putative del genoma o le mutazioni mirate utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas mediante analisi focalizzata sui genomi degli spermatozoi maschili F0. Questo protocollo dovrebbe essere suscettibile di altri modelli animali in cui lo sperma è prontamente disponibile per il campionamento senza eutanasia. Questo metodo aumenterà il throughput dello screening per le modifiche desiderate ed è particolarmente utile per identificare rari eventi k...

Il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas è un potente strumento per eseguire mutagenesi loci-specifica e editing preciso del genoma nel sistema modello Danio rerio (zebrafish) 1,2,3,4. La Cas-ribonucleoproteina (RNP) è composta da due componenti principali: un'endonucleasi Cas (comunemente Cas9 o Cas12a) e un RNA guida sintetico locus-specifico (sgRNA)5. Insieme, il Cas-RNP genera una rottura a doppio filamento (DSB) nel locus desiderato che può essere riparata da uno dei due meccanismi di riparazione intrinseca. Il meccanismo di riparazione della giunzione finale non omologa (NHEJ) è soggetto a errori e spesso si traduce in una varietà di inserzioni o delezioni (indel) attorno al DSB. Questi indels possono essere deleteri se introducono una mutazione frameshift o un arresto prematuro nella sequenza proteica risultante. In alternativa, il meccanismo di riparazione diretta dall'omologia (HDR) utilizza un modello di donatore con regioni di omologia che circondano il sito DSB per riparare il danno. I ricercatori possono sfruttare il sistema HDR per generare modifiche genomiche precise. In particolare, possono co-iniettare un costrutto di donatore di DNA a doppio filamento che contiene le modifiche desiderate e le regioni di omologia che fiancheggiano il sito DSB nel genoma. La maggiore economia di scala per questi componenti CRISPR prodotti commercialmente ha notevolmente ridotto le barriere allo screening di più loci e alla creazione di sforzi su larga scala per l'editing preciso del genoma. Tuttavia, nei modelli animali che si riproducono sessualmente, un importante collo di bottiglia è l'identificazione e l'isolamento di animali mutanti stabili alla linea germinale.
Il sistema modello zebrafish presenta diverse qualità chiave che ne migliorano l'uso negli studi genetici inversi. Sono facili da allevare in gran numero con attrezzature di base per l'alloggiamento acquatico e le femmine mostrano un'elevata fecondità tutto l'anno6. Inoltre, la loro deposizione esterna delle uova e la fertilizzazione li rendono suscettibili alla microiniezione di componenti CRISPR / Cas. Il Cas-RNP viene comunemente iniettato in embrioni di zebrafish a una cellula per generare DSB / riparazione che è, in teoria, ereditato da tutte le cellule figlie. Tuttavia, i genomi diploidi richiedono due eventi DSB/riparazione per mutagenizzare entrambi i cromosomi omologhi. Inoltre, sebbene Cas-RNP venga iniettato allo stadio di una cellula, il DSB / riparazione potrebbe non verificarsi fino a punti successivi nello sviluppo. Insieme, questi fattori contribuiscono alla natura a mosaico del pesce iniettato con F0. Una pratica comune è quella di incrociare i pesci iniettati con F0 e controllare la progenie F1 per indel/modifiche specifiche. Tuttavia, poiché non tutti i pesci iniettati con F0 possiedono mutazioni germinali, questa pratica si traduce in molti incroci improduttivi che non generano la modifica desiderata. Lo screening della linea germinale F0 piuttosto che del tessuto somatico F1 aumenta la probabilità di isolare la modifica germinale desiderata e riduce il numero di animali necessari in questo processo.
Lo sperma può essere facilmente raccolto dal pesce zebra iniettato con F0 senza bisogno di eutanasia. Questa caratteristica consente la crioconservazione e la riderivazione di scorte di spermatozoi congelati7 ma può anche essere sfruttata per vagliare, identificare e isolare rapidamente i portatori della linea germinale delle mutazioni genomiche desiderate 8,9. Brocal et al. (2016) hanno precedentemente descritto un metodo basato sul sequenziamento per lo screening delle modifiche della linea germinale nel pesce zebra maschio iniettato con F010. Sebbene utile per identificare gli alleli mutati presenti nella linea germinale, questo approccio può diventare costoso in termini di produttività elevata e potrebbe non essere accessibile a tutti i laboratori. Al contrario, il protocollo attuale offre una strategia basata sull'elettroforesi accessibile ed economica per identificare le modifiche della linea germinale. In particolare, questo protocollo delinea un metodo robusto per lo screening e l'isolamento delle mutazioni germinali in loci specifici utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio ad alta risoluzione. Inoltre, questo protocollo descrive una strategia simile per identificare l'integrazione riuscita di un costrutto donatore contenente modifiche specifiche. Come sempre, se si desiderano modifiche specifiche, le strategie basate sul sequenziamento possono essere eseguite in tandem con il protocollo descritto di seguito. Sebbene questo protocollo sia specifico per il sistema modello del pesce zebra, questi principi dovrebbero essere adattabili a qualsiasi modello in cui la raccolta di spermatozoi è una procedura di routine. Insieme, queste strategie consentiranno l'identificazione di maschi iniettati in F0 con indels/edits germinali che possono essere risolti su un gel dopo reazione a catena della polimerasi standard (PCR) e/o digestione di restrizione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding tanks</td>
			<td>Carolina Biological&#160;</td>
			<td>161937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstNI Restriction Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0168S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Endonuclease</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder, 100 bp&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>FERSM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 donor construct&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. 
			Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5&#8217; and 3&#8217; ends (5&#39;-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC 
			TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT 
			GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC 
			AGTGATTACGTCACGC-3&#39;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 forward primer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5&#39;-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT 
			TTGGC-3&#39;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 reverse primer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (&#39;5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA 
			ATACAGC-3&#39;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego&#160;</td>
			<td>Synthetic sgRNA, target sequence: 5&#39;-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>105ECA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter forceps</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish (system) water</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging light box&#160;</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>AZI200-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel stain, 10000X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bowl, 250 mL&#160;</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation tanks, 0.8 L&#160;</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcap capillary tube with bulb, 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-0020/CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicentrifuge</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12011919EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes, various with appropriate tips</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P119-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 0.2 mL</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3196-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon, with drilled holes/slots&#160;</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl solution, 0.2 M RNAse Free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p2ry12 forward primer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5&#39;-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT 
			-3&#39;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p2ry12 reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5&#39;-CCAGGAACACATTAACCTGGAT 
			-3&#39;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p2ry12 synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego&#160;</td>
			<td>Synthetic sgRNA, target sequence: 5&#39;-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzyme 10X Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6003SVIAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 50 mM&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>S318; 424330010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase master mix, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer Concentrate, 10X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0&#177;0.2)&#160;</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>200-266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0)&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening sperm for the rapid isolation of germline edits in zebrafish

L'avvento delle tecnologie mirate di nucleasi CRISPR-Cas ha rivoluzionato la capacità di eseguire un accurato editing del genoma in sistemi modello sia consolidati che emergenti. I sistemi di editing del genoma CRISPR-Cas utilizzano un RNA guida sintetico (sgRNA) per indirizzare un'endonucleasi associata a CRISPR (Cas) a specifici loci del DNA genomico, dove l'endonucleasi Cas genera una rottura a doppio filamento. La riparazione delle rotture del doppio filamento mediante meccanismi intrinseci soggetti a errori porta a inserimenti e / o delezioni, interrompendo il locus. In alternativa, l'inclusione di donatori di DNA a doppio filamento o oligonucleotidi di DNA a singolo filamento in questo processo può suscitare l'inclusione di precise modifiche del genoma che vanno dai polimorfismi a singolo nucleotide a piccoli tag immunologici o persino grandi costrutti proteici fluorescenti. Tuttavia, un importante collo di bottiglia in questa procedura può essere trovare e isolare la modifica desiderata nella linea germinale. Questo protocollo delinea un metodo robusto per lo screening e l'isolamento delle mutazioni germinali in loci specifici in Danio rerio (zebrafish); Tuttavia, questi principi possono essere adattabili in qualsiasi modello in cui è possibile la raccolta di spermatozoi in vivo .

Gli approcci sperimentali descritti in questo protocollo consentono la più rapida identificazione di modifiche del genoma o presunti alleli deleteri concentrandosi sull'analisi di migliaia di genomi derivati dalla raccolta di spermatozoi maschili iniettati in F0. La Figura 2 illustra come interpretare i risultati ottenuti utilizzando questo protocollo.
Per generare mutazioni nel locus p2ry12, sono stati iniettati embrioni di zebrafish a una cellula con endonuclea...

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Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell'editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Questo protocollo descrive un metodo per lo screening rapido di migliaia di genomi utilizzando lo sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR. Questa tecnica è vantaggiosa nella sua accessibilità. Piuttosto che costosi approcci specializzati basati sul sequenziamento, il nostro metodo utilizza enzimi di restrizione PCR ed elettroforesi su gel per lo screening dei portatori maschi F0 per indels o modifiche specifiche del genoma.La parte più difficile di questa procedura è solo ottenere rapidamente lo sperma, ma diventa una buona tecnica per la fecondazione in vitro se lavoriamo con molti pesci dismorfici, e quindi è un modo semplice per noi di incrociare i pesci che ci stanno dando problemi. Inizia allestendo vasche di riproduzione sia per il tipo selvatico che per i pesci F0 e incubare le vasche durante la notte. Dopo aver anestetizzato il pesce maschio il giorno successivo, utilizzare un mestolo forato per trasferirlo su una pila di asciugamani di carta pulita.Rotolare delicatamente il pesce per rimuovere l'acqua in eccesso. Rimuovere l'acqua asciugandola con un fazzoletto piegato pulito. Usando il mestolo forato, trasferire il pesce nella spugna preparata.Posizionare il pesce con il lato ventrale verso l'alto e asciugare delicatamente l'area intorno alle pinne anali con una carta velina piegata pulita. Per raccogliere lo sperma, utilizzare un tubo capillare per spostare delicatamente le pinne pelviche lontano dalla linea mediana, esponendo la cloaca. Posizionare il tubo capillare vicino alla cloaca.Con le dita o un paio di pinze da filtro, spremere delicatamente i lati del pesce dalle branchie verso il basso. Utilizzando l'azione capillare, raccogliere lo sperma nel tubo e metterlo in una provetta PCR contenente 40 microlitri di soluzione di idrossido di sodio 50 millimolare, quindi espellere il campione nella provetta. Dopo aver fatto girare i campioni di sperma in una mini centrifuga, posizionare i tubi PCR in un termociclatore.Far funzionare il ciclatore riscaldando i campioni per 40 minuti a 95 gradi Celsius seguito da raffreddamento a 25 gradi Celsius. Dopo aver rimosso i campioni dal ciclatore, neutralizzare il pH aggiungendo 10 microlitri di un molare tris cloridrato di pH otto. Mescolare aspirando la sospensione e quindi centrifugare i campioni.Impostare il termociclatore a 95 gradi Celsius per il preriscaldamento. E nel frattempo, preparare 25 microlitri della miscela di reazione PCR per ogni campione di sperma. Mescolare bene pipettando su e giù, quindi girare i campioni.Posizionare i campioni nel termociclatore preriscaldato e impostare il ciclo. Per ottenere una soluzione di gel, microonde una soluzione di gel di agarosio al 4% preparata mescolando polvere di agarosio, colorazione di gel e tampone TBE. Versare la soluzione di gel in un telaio di fusione in gel e inserire un pettine su un lato.Dopo la solidificazione del gel, rimuovere con cura il pettine. Posizionare il gel in un impianto di elettroforesi in modo tale che i pozzetti siano più vicini all'elettrodo negativo. Versare il buffer di funzionamento TBE nel carro fino a quando i pozzi non sono completamente sommersi.Inizia a caricare il gel pipettando cinque microlitri di scala del DNA nel primo pozzetto. Caricare i pozzetti rimanenti con 5-10 microlitri di prodotto PCR. Far funzionare il gel per 1 ora a 150 volt per garantire un'adeguata separazione degli ampliconi.Utilizzare l'imager gel per visualizzare le bande del DNA. L'analisi del locus p2ry12 ha mostrato che l'amplicone wild-type mostrava una singola banda di 250 coppie di basi mentre gli ampliconi maschi iniettati con F0 contenenti indels funzionavano come bande multiple. L'analisi del locus DNA10 ha mostrato che l'amplicone wild-type funziona come una singola banda lunga di 400 coppie di basi.Gli ampliconi maschili iniettati con F0 contenenti indels funzionavano come bande multiple o come una singola banda con ridotta mobilità del gel. Il maschio iniettato con F0 numero uno aveva una banda aggiuntiva nel prodotto digerito, che era assente nel prodotto PCR, rendendolo il miglior candidato fondatore per la creazione di linee knock-in mutanti. Se un pesce maschio non produce spermatozoi quando viene spremuto, è meglio riposare il pesce per una settimana e riprovare invece di schiacciarli troppo forte e rischiare di ferirli.Una volta che il fondatore FC o maschio è outcross, gli alleli devono essere verificati in sequenza nella progenie F1. Sequenziare direttamente gli ampliconi F1 ed eseguire l'analisi degli alleli eterozigoti è un modo semplice per farlo.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Genetica

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