Name: screening sperm for the rapid isolation of germline edits in zebrafish
Uploaded: 2023-02-10T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish at JoVE.com

Vi vill tacka Anna Hindes vid Washington University School of Medicine för hennes första ansträngningar för att erhålla spermiegenomiskt DNA av god kvalitet med hjälp av hot shot-metoden. Detta arbete finansierades av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award (R01AR072009 till RSG).

Denna studie genomfördes i enlighet med riktlinjerna i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals från National Institutes of Health. Protokollet godkändes av University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee (AUP-2021-00254).
1. Designa sgRNA för CRISPR-mutagenes
<ol><li>Hämta exonsekvensen som innehåller målplatsen.</li>
	<li>Designa ett syntetiskt guide-RNA (sgRNA) med ett protospacer intilliggande motiv (PAM) -ställe som är specifikt för Cas-end...

<ol>
	<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li><li>Troutwine, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reissner+fiber+is+highly+dynamic+in+vivo+and+controls+morphogenesis+of+the+spine.">The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine.</a> Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).</li><li>Xu, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems:+Overview,+innovations+and+applications+in+human+disease+research+and+gene+therapy.">CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).</li><li>Creaser, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+technic+of+handling+the+zebrafish+(Brachydanio+rerio)+for+the+production+of+eggs+which+are+favorable+for+embryological+research+and+are+available+at+any+specified+time+throughout+the+year.">The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year.</a> Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).</li><li>Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservatin+and+in+vitro+fertilization+at+the+zebrafish+international+resource+center.">Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).</li><li>Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axonemal+dynein+heavy+chain+10+gene+is+essential+for+monocilia+motility+and+spine+alignment+in+zebrafish.">The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish.</a> Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).</li><li>Gray, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+screen+for+mutations+affecting+spine+development+in+zebrafish.">Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).</li><li>Brocal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+CRISPR/Cas9-induced+insertions/deletions+by+direct+germline+screening+in+zebrafish.">Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish.</a> BMC Genomics. 17, 259 (2016).</li><li>Davis, M. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApE,+A+Plasmid+Editor:+A+freely+available+DNA+manipulation+and+visualization+program.">ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program.</a> Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).</li><li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v3:+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing.">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li><li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+Peak+Parser:+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products.">Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-TOM:+A+platform+for+high-throughput+tracking+of+mutations+induced+by+CRISPR/Cas+systems.">Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems.</a> Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+identification+of+CRISPR/Cas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio.">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Draper, B. W., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+zebrafish+sperm+cryopreservation+and+in+vitro+fertilization.">A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).</li><li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants.">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en metod för att snabbt karakterisera förmodade genomredigeringar eller riktade mutationer med hjälp av CRISPR-Cas-teknik genom fokuserad analys på F0 manliga spermiegenom. Detta protokoll bör vara mottagligt för andra djurmodeller där spermier är lätt tillgängliga för provtagning utan avlivning. Den här metoden ökar genomströmningen för screening av önskade redigeringar och är särskilt användbar för att identifiera sällsynta HDR-medierade dominoningshändelser. Detta tillv?...

CRISPR-systemet (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas är ett kraftfullt verktyg för att utföra loci-specifik mutagenes och exakt genomredigering i Danio rerio (zebrafisk) modellsystem 1,2,3,4. Cas-ribonukleoproteinet (RNP) består av två huvudkomponenter: ett Cas-endonukleas (vanligtvis Cas9 eller Cas12a) och ett lokusspecifikt syntetiskt guide-RNA (sgRNA)5. Tillsammans genererar Cas-RNP ett dubbelsträngat brott (DSB) i önskad plats som kan repareras med en av två inneboende reparationsmekanismer. Den icke-homologa ändfogningsmekanismen (NHEJ) är felbenägen och resulterar ofta i en mängd olika infogningar eller borttagningar (indels) runt DSB. Dessa indels kan vara skadliga om de introducerar en frameshift-mutation eller för tidigt stopp i den resulterande proteinsekvensen. Alternativt använder den homologiriktade reparationsmekanismen (HDR) en givarmall med homologiregioner som omger DSB-webbplatsen för att reparera skadan. Forskare kan dra nytta av HDR-systemet för att generera exakta genomiska redigeringar. Specifikt kan de saminjicera en dubbelsträngad DNA-donatorkonstruktion som innehåller de önskade redigeringarna såväl som homologiregioner som flankerar DSB-platsen i genomet. Den ökade stordriftsekonomin för dessa kommersiellt producerade CRISPR-komponenter har kraftigt minskat hindren för screening av flera loci och för att inrätta storskaliga insatser för exakt genomredigering. Men i sexuellt reproducerande djurmodeller är en stor flaskhals identifieringen och isoleringen av germline-stabila mutanta djur.
Zebrafiskmodellsystemet uppvisar flera viktiga egenskaper som förbättrar dess användning i omvända genetiska studier. De är lätta att föda upp i stort antal med grundläggande vattenlevande husutrustning, och honor uppvisar hög fecundity året runt6. Dessutom gör deras yttre äggläggning och befruktning dem mottagliga för mikroinjektion av CRISPR / Cas-komponenter. Cas-RNP injiceras vanligen i zebrafiskembryon i encellsstadium för att generera DSB/reparation som i teorin ärvs av alla dotterceller. Diploida genom kräver dock två DSB/reparationshändelser för att mutagenisera båda homologa kromosomerna. Dessutom, även om Cas-RNP injiceras i encellsstadiet, kan DSB/reparation inte ske förrän senare i utvecklingen. Tillsammans bidrar dessa faktorer till mosaikens natur hos F0-injicerad fisk. En vanlig praxis är att korsa F0-injicerad fisk och screena F1-avkomman för indels/specifika redigeringar. Men eftersom inte alla F0-injicerade fiskar har könsmutationer, resulterar denna praxis i många improduktiva korsningar som inte genererar önskad redigering. Screening av F0-könslinjen snarare än F1-somatisk vävnad ökar sannolikheten för att isolera den önskade könscellredigeringen och minskar antalet djur som krävs i denna process.
Spermier kan enkelt samlas in från F0-injicerade zebrafiskar utan behov av eutanasi. Denna funktion möjliggör kryokonservering och rederivation av frysta spermiestammar7 men kan också utnyttjas för att snabbt screena, identifiera och isolera könscellsbärarna av önskade genomiska mutationer 8,9. Brocal et al. (2016) beskrev tidigare en sekvenseringsbaserad metod för screening av könslinjeredigeringar i F0-injicerade manliga zebrafiskar10. Även om det är användbart för att identifiera de muterade allelerna som finns i könslinjen, kan detta tillvägagångssätt bli kostsamt vid hög genomströmning och kanske inte är tillgängligt för alla laboratorier. Däremot erbjuder det nuvarande protokollet en lättillgänglig och kostnadseffektiv elektroforesbaserad strategi för att identifiera könsredigeringar. Specifikt beskriver detta protokoll en robust metod för screening och isolering av germlinemutationer vid specifika loci med hjälp av högupplöst agarosgelelektrofores. Dessutom beskriver detta protokoll en liknande strategi för att identifiera framgångsrik integration av en givarkonstruktion som innehåller specifika redigeringar. Som alltid, om specifika redigeringar önskas, kan sekvenseringsbaserade strategier utföras tillsammans med protokollet som beskrivs nedan. Även om detta protokoll är specifikt för zebrafiskmodellsystemet, bör dessa principer kunna anpassas till alla modeller där insamling av spermier är ett rutinförfarande. Tillsammans kommer dessa strategier att möjliggöra identifiering av F0-injicerade hanar med germline indels/redigeringar som kan lösas på en gel efter standard polymeraskedjereaktion (PCR) och/eller restriktionssmältning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding tanks</td>
			<td>Carolina Biological&#160;</td>
			<td>161937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstNI Restriction Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0168S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Endonuclease</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder, 100 bp&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>FERSM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 donor construct&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. 
			Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5&#8217; and 3&#8217; ends (5&#39;-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC 
			TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT 
			GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC 
			AGTGATTACGTCACGC-3&#39;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 forward primer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5&#39;-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT 
			TTGGC-3&#39;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 reverse primer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (&#39;5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA 
			ATACAGC-3&#39;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego&#160;</td>
			<td>Synthetic sgRNA, target sequence: 5&#39;-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>105ECA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter forceps</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish (system) water</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging light box&#160;</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>AZI200-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel stain, 10000X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bowl, 250 mL&#160;</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation tanks, 0.8 L&#160;</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcap capillary tube with bulb, 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-0020/CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicentrifuge</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12011919EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes, various with appropriate tips</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P119-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 0.2 mL</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3196-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon, with drilled holes/slots&#160;</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl solution, 0.2 M RNAse Free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p2ry12 forward primer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5&#39;-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT 
			-3&#39;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p2ry12 reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5&#39;-CCAGGAACACATTAACCTGGAT 
			-3&#39;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p2ry12 synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego&#160;</td>
			<td>Synthetic sgRNA, target sequence: 5&#39;-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzyme 10X Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6003SVIAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 50 mM&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>S318; 424330010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase master mix, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer Concentrate, 10X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0&#177;0.2)&#160;</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>200-266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0)&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening sperm for the rapid isolation of germline edits in zebrafish

Tillkomsten av riktade CRISPR-Cas-nukleasteknologier har revolutionerat förmågan att utföra exakt genomredigering i både etablerade och framväxande modellsystem. CRISPR-Cas genomredigeringssystem använder ett syntetiskt guide-RNA (sgRNA) för att rikta ett CRISPR-associerat (Cas) endonukleas till specifika genomiska DNA-loci, där Cas-endonukleas genererar en dubbelsträngbrytning. Reparation av dubbelsträngade brott genom inneboende felbenägna mekanismer leder till infogningar och / eller borttagningar, vilket stör platsen. Alternativt kan införandet av dubbelsträngade DNA-donatorer eller enkelsträngade DNA-oligonukleotider i denna process framkalla införandet av exakta genomredigeringar som sträcker sig från enkla nukleotidpolymorfismer till små immunologiska taggar eller till och med stora fluorescerande proteinkonstruktioner. En stor flaskhals i denna procedur kan dock vara att hitta och isolera önskad redigering i könslinjen. Detta protokoll beskriver en robust metod för screening och isolering av germlinemutationer vid specifika loci i Danio rerio (zebrafisk); Dessa principer kan dock vara anpassningsbara i alla modeller där spermainsamling in vivo är möjlig.

De experimentella tillvägagångssätten som beskrivs i detta protokoll möjliggör snabbare identifiering av genomredigeringar eller förmodade skadliga alleler genom att fokusera på analys av tusentals genom som härrör från insamling av F0-injicerade manliga spermier. Figur 2 belyser hur man tolkar de resultat som erhållits med hjälp av detta protokoll.
För att generera mutationer i p2ry12-lokus injicerades zebrafiskembryon i encellsstadium med Cas9-endon...

Watch this Scientific Journal Video about Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish at JoVE.com

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

CRISPR-Cas-teknologier har revolutionerat området genomredigering. Att hitta och isolera den önskade könsredigeringen är dock fortfarande en stor flaskhals. Därför beskriver detta protokoll en robust metod för att snabbt screena F0 CRISPR-injicerade zebrafiskspermier för könsredigeringar med hjälp av standard PCR, restriktionssmälta och gelelektroforestekniker.

Screening spermier för snabb isolering av germline redigeringar i zebrafisk

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Detta protokoll beskriver en metod för att snabbt screena tusentals genom med F0 CRISPR-injicerade zebrafiskspermier. Denna teknik är fördelaktig i sin tillgänglighet. I stället för dyra, specialiserade sekvenseringsbaserade tillvägagångssätt använder vår metod PCR-restriktionsenzymer och gelelektrofores för att screena F0-manliga bärare för indels eller specifika genomredigeringar.Den svåraste delen av denna procedur är bara att få spermierna snabbt, men det blir en bra teknik för in vitro-fertilisering om vi arbetar med mycket dysmorf fisk, och så är det ett enkelt sätt för oss att korsa fisk som ger oss problem. Börja med att sätta upp avelstankar för både vildtyp och F0-fisk och inkubera tankarna över natten. Efter att ha bedövat hanfisken nästa dag, använd en hålslev för att överföra den till en bunt rena pappershanddukar.Rulla försiktigt fisken för att ta bort överflödigt vatten. Ta bort allt vatten genom att torka det torrt med en ren veckad vävnad. Överför fisken till den förberedda svampen med den slitsade skeden.Placera fisken ventralt uppåt och torka försiktigt området runt analfenorna med ett rent vikt silkespapper. För att samla spermierna, använd ett kapillärrör för att försiktigt flytta bäckenfenorna bort från mittlinjen och exponera cloaca. Placera kapillärröret nära cloaca.Med fingrarna eller ett par filterpincett, pressa försiktigt fiskens sidor från gälarna ner. Använd kapillärverkan, samla spermierna i röret och placera det i ett PCR-rör innehållande 40 mikroliter 50 millimolär natriumhydroxidlösning och utvisa sedan provet i röret. Efter att ha snurrat spermaproverna i en minicentrifug, placera PCR-rören i en termisk cykler.Kör cyklaren genom att värma proverna i 40 minuter vid 95 grader Celsius följt av kylning vid 25 grader Celsius. Efter avlägsnande av proverna från cyklaren, neutralisera pH genom tillsats av 10 mikroliter av en molar trishydroklorid med pH åtta. Blanda genom att aspirera suspensionen och centrifugera sedan proverna.Ställ in värmecykeln på 95 grader Celsius för förvärmning. Och under tiden förbereda 25 mikroliter av PCR-reaktionsblandningen för varje spermaprov. Blanda väl genom pipettering upp och ner och snurra sedan proverna.Placera proverna i den förvärmda termiska cykeln och ställ in cykeln. För att erhålla en gellösning, mikrovågsugn en 4% agarosgellösning beredd genom blandning av agarospulver, gelfläck och TBE-buffert. Häll gellösningen i en gelgjutningsram och sätt in en kam på ena sidan.Efter gelstelning, ta försiktigt bort kammen. Placera gelén i en elektroforesrigg så att brunnarna är närmast den negativa elektroden. Häll TBE-bufferten i riggen tills brunnarna är helt nedsänkta.Börja ladda gelén genom att pipettera fem mikroliter DNA-stege i den första brunnen. Ladda de återstående brunnarna med 5 till 10 mikroliter av PCR-produkten. Kör gelén i 1 timme vid 150 volt för att säkerställa tillräcklig separation av amplikonerna.Använd gelkameran för att visa DNA-banden. P2Ry12 locusanalys visade att vildtypamplikonen visade ett enda band med 250 basparlängd medan de F0-injicerade manliga amplikonerna innehållande indels sprang som flera band. DNAH10 locus-analys visade att vildtypamplikon körs som ett enda 400 baspar långt band.F0-injicerade manliga amplikoner innehållande indels kördes som flera band eller som ett enda band med minskad gelrörlighet. Den F0-injicerade manliga nummer ett hade ett extra band i den smälta produkten, som saknades i PCR-produkten, vilket gjorde den till den bästa grundarkandidaten för mutant knock-in line-etablering. Om en manlig fisk inte producerar spermier när den pressas, är det bäst att vila fisken i en vecka och försöka igen istället för att klämma dem för hårt och riskera att skada dem.När FC eller den manliga grundaren är utkorsad måste allelerna sekvensverifieras i F1-avkomman. Att sekvensera F1-amplikonerna direkt och utföra heterozygot allelanalys är ett enkelt sätt att göra detta.

Research

JoVE Journal

Genetics

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Nya RNA-bindande proteiner Isolering av den snabba Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Hög genomströmning Robotsvetsad Assisted Isolering av temperaturkänslig dödliga mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyd-assisted isolering av reglerande element till åtgärd kromatin tillgänglighet i däggdjursceller

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parning-baserade överuttryck bibliotek Screening i jäst

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolering, karakterisering och mikroRNA-baserad genetisk modifiering av mänskliga dentala follikeln stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening av bomull genotyper för reniform Nematodresistens

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karaktärisera Histon posttranslationella modifieringen förändringar i jäst neurodegenerativa Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Utredning av den transkriptionella roll som en RUNX1 Intronic ljuddämpare av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akut myeloisk leukemi celler

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...