Name: malachite green assay for the discovery of heat-shock protein 90 inhibitors
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Korea Research Fellowship (KRF) -programmet, postdoc ved National Research Foundation of Korea (NRF), finansieret af ministeriet for videnskab og IKT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Forfatterne er taknemmelige for KIST intramural grant og Ministry of Oceans and Fisheries bevilling nummer 2MRB130 for at yde økonomisk bistand til dette projekt.

1. Malakitgrøn analyse i laboratorieskala
<ol><li>Fremstilling af assaybuffer<ol><li>Forbered analysebufferen i henhold til sammensætningen og præparatet præsenteret i tabel 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Fremstilling af fosfatstandarder<ol><li>Brug 1 mM fosfatstandard, der leveres i det malakitgrønne assayphosphatassaysæt (opbevares ved 4 °C).</li>
		<li>Pipette 40 μL 1 mM fosfatstandard i 960 μL ultrarent vand for at opnå 40 μM fosfatopløsning (forblandingsopløsning). Tilsæt ...

<ol>
	<li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone.">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li><li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis:+emerging+mechanistic+insights.">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li><li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP90+for+cancer+therapy.">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li><li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents.">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li><li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics.">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).</li><li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging.">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li><li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery.">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li><li>Park, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90,+Grp94,+and+TRAP1.">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental &amp; molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li><li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pimitespib:+first+approval.">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li><li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins:+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation.">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90:+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation.">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90.">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90&#945;+inhibitors.">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90&#945; inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90&#945;+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure.">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90&#945; inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90&#945;+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors.">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90&#945; docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li><li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors:+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead.">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate:+mechanism+and+application.">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li><li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+docking+study,+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors.">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors.">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein &amp; Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li><li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers.">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li><li>Mahapatra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+90+(Hsp90)+inhibitory+potentials+of+some+chalcone+compounds+as+novel+anti-proliferative+candidates.">Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates.</a> Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).</li><li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90:+enabler+of+cancer+adaptation.">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li><li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis,+prognosis,+metabolism+and+treatment.">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).</li><li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Hsp90&#946;-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition.">The development of Hsp90&#946;-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li><li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor.">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).</li><li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells.">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li><li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo.">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li><li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases.">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 221, 107747 (2021).</li><li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90.">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li><li>Opali&#324;ska, M., Ja&#324;ska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAA+proteases:+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis.">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163 (2018).</li><li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+therapeutic+potential,+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones.">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li><li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase,+substrate+translocation+and+proteolytic+activity.">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li></ol>

Hsp90 er et vigtigt mål for opdagelsen af nye anticancer-lægemiddelmolekyler. Siden dets lægemiddelbarhed blev etableret i 1994, har10, 18 molekyler nået kliniske forsøg. På nuværende tidspunkt er syv molekyler i forskellige faser af kliniske forsøg, enten alene eller i kombination22. Alle sådanne små molekyler er N-terminale ATP-bindende hæmmere. De andre midler til at hæmme chaperon (C-terminale hæmmere, mellemdomænehæmmere) er ikke gået så hurtigt som N-...

Varmechokprotein 90 (Hsp90) er en molekylær chaperon, der opretholder stabiliteten af proteiner, der er ansvarlige for udvikling og progression af kræft. Derudover er proteiner, der er ansvarlige for udviklingen af resistens over for antineoplastiske midler, også klienter af Hsp901. Hsp90 er allestedsnærværende i alle kræftcelletyper (>90% af cellulære proteiner) sammenlignet med normale celler, hvor det kan udgøre mindre end 2% af de samlede proteiner. Desuden befinder kræftcellernes Hsp90 sig i et kompleks med co-chaperoner, mens det i en normal celle overvejende er til stede i en fri, ukomplekset tilstand 2,3. I de senere år har flere Hsp90-hæmmere vist sig at have senolytiske virkninger i in vitro- og in vivo-studier, hvor de signifikant har forbedret levetiden for mus 4,5,6. Alle de ovennævnte resultater underbygger det faktum, at Hsp90-hæmmere kan være effektive i flere kræfttyper med færre bivirkninger og reducerede chancer for at udvikle resistens. Chaperoneringsfunktionen af Hsp90 opnås ved at binde ATP på det N-terminale domæne af Hsp90 og hydrolysere det til ADP og frit fosfat7. Små molekyler, der konkurrencedygtigt binder til ATP-bindingslommen af Hsp90, viste sig at undertrykke proteinets chaperonerende virkning. Til dato er dette fortsat den bedste strategi for Hsp90-hæmning, hvilket understøttes af, at sådanne hæmmere har nået kliniske forsøg8. En af dem, Pimitespib, blev godkendt i Japan til behandling af gastrointestinal stromal tumor (GIST) i juni 20229. Dette er den første Hsp90-hæmmer godkendt siden lægemidletgabilitet af chaperon blev etableret i 199410.
Malachitgrøn analyse er en enkel, følsom, hurtig og billig procedure til påvisning af uorganisk fosfat, egnet til automatisering og high-throughput screening (HTS) af forbindelser mod det ønskede mål11. Analysen er med succes blevet anvendt til screening af Hsp90-hæmmere i små laboratorieskalaopsætninger såvel som i en HTS 12,13,14,15,16,17. Assayet bruger en kolorimetrisk metode, der bestemmer det frie uorganiske fosfat dannet på grund af ATPase-aktiviteten af Hsp90. Grundlaget for denne kvantificering er dannelsen af et phosphomolybdatkompleks mellem frit phosphat og molybdæn, som efterfølgende reagerer med malachitgrøn for at generere en grøn farve (figur 1). Denne hurtige farvedannelse måles på et spektrofotometer eller på en pladelæser mellem 600-660 nm18,19.
I denne protokol beskrives proceduren for udførelse af et malachitgrønt assay med gær Hsp90 og efterfølgende identifikation af inhibitorer mod chaperonen. Det naturlige produktmolekyle, geldanamycin (GA), med hvilket lægemiddelbarheden af Hsp90 først blev etableret, blev taget som en autentisk hæmmer10. HTS er blevet en integreret del af det nuværende lægemiddelforskningsprogram på grund af tilgængeligheden af et stort antal molekyler til testning. Denne teknik har fået større betydning i de sidste 2 år på grund af det presserende behov for genanvendelse af lægemidler til behandling af Covid-19-infektion20,21. Derfor præsenteres en detaljeret oversigt over HTS af molekyler mod gær Hsp90-protein ved at vedtage den malachitgrønne analysemetode.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1M Magnesium chloride solution in water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Potassium chloride solution in water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FX laboratory automation workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds 3-96</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geldanamycin, 99% (HPLC), powder</td>
			<td>AK Scientific, Inc.</td>
			<td>V2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite Green Phosphate Assay&#160; Assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAK307-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek Instruments, Inc.</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT multi-plate reader</td>
			<td>Biotek Instruments, Inc.</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93313-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Hsp90</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

malachite green assay for the discovery of heat-shock protein 90 inhibitors

Varmechokprotein 90 (Hsp90) er et lovende anticancermål på grund af dets chaperonerende effekt på flere onkogene proteiner. Aktiviteten af Hsp90 er afhængig af dets evne til at hydrolysere adenosintrifosfat (ATP) til adenosindiphosphat (ADP) og frit fosfat. ATPase-aktiviteten af Hsp90 er knyttet til dens chaperoning-funktion; ATP binder sig til Hsp90's N-terminale domæne, og afbrydelse af dets binding viste sig at være den mest succesrige strategi til at undertrykke Hsp90-funktionen. ATPaseaktiviteten kan måles ved et kolorimetrisk malachitgrønt assay, som bestemmer mængden af frit fosfat dannet ved ATP-hydrolyse. Her beskrives en procedure til bestemmelse af ATPaseaktiviteten af gær Hsp90 ved anvendelse af malachitgrønt fosfatanalysesæt. Yderligere gives detaljerede instruktioner til opdagelsen af Hsp90-hæmmere ved at tage geldanamycin som en autentisk hæmmer. Endelig diskuteres anvendelsen af denne assayprotokol gennem high-throughput screening (HTS) af inhibitormolekyler mod gær Hsp90.

Resultaterne af analysen fortolkes som absorbans på grund af fri fosfationkoncentration. Absorbansen af frit phosphat som følge af ATP-hydrolyse af gæren Hsp90 ved 620 nm betragtes som 100% ATPase-aktivitet eller nul procent proteinhæmning. Inhiberingen af protein fører til ophør af ATP-hydrolyse (mindre frit fosfat). hvilket afspejles i form af nedsat absorbans ved 620 nm.
Resultater af malakitgrøn analyse i laboratorieskala Standardgrafen for fosfatstandarden er vi...

Watch this Scientific Journal Video about Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors at JoVE.com

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

Malachitgrøn assay-protokollen er en enkel og omkostningseffektiv metode til at opdage varmechokprotein 90 (Hsp90) suppressorer samt andre inhibitorforbindelser mod ATP-afhængige enzymer.

Malakitgrøn analyse til opdagelse af varmechokprotein 90-hæmmere

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

Denne protokol vil hjælpe med at bestemme aktiviteten for ATPase-proteiner ved at måle det frie fosfat som følge af ATP-hydrolyse af proteinerne. Malachitgrøn analyse er en enkel, følsom, hurtig og billig procedure til påvisning af uorganisk fosfat. Det er velegnet til automatisering og high-throughput screening af forbindelser mod sit mål.Denne teknik vil spille en vigtig rolle i den hurtige opdagelse af inhibitorer mod Hsp90-proteinet, som er et vigtigt mål mod kræft. Til at begynde med, pipette 40 mikroliter en-millimolær phosphatstandard i 960 mikroliter ultrarent vand for at opnå 40-mikromolær fosfatopløsning. Tilsæt denne opløsning i henhold til producentens anvisninger for at danne en seriel fortynding af fosfat fra 0 til 40 mikromolar.Brug derefter otte mikroliter gær Hsp90 til målbar ATPase-aktivitet. Der tilsættes malachitgrønt reagens til blindprøven og den positive kontrol, og forskellen mellem den optiske densitet mellem blindprøven og den positive kontrol kontrolleres efter tilsætningen er mindst 0,5 og mindre end 1. For at forberede ATP overføres et milligram ATP til et hætteglas indeholdende 453,39 mikroliter ultrarent vand for at opnå fire millimolær stamopløsning.Forbered ATP frisk, da den spontant kan hydrolysere over tid. Tilsæt fire mikroliter ATP-stamopløsning til hver brønd for at give en endelig brøndkoncentration på 0,2 millimolar. Tilsæt ATP som den sidste komponent til reaktionen ved hjælp af en flerkanalpipette, så alle reaktionerne starter samtidigt.Derefter fremstilles en 10 millimolær bestand geldanamycin ved at opløse et milligram i 178, 37 mikroliter DMSO. Ved hjælp af stamopløsningen fremstilles 4-millimolar, 0,8 millimolar, 0,16-millimolar, 0,032-millimolar, 0,0064-millimolær og 0,00128-millimolær opløsning i DMSO ved seriel fortynding. Tilsæt to mikroliter af disse stamopløsninger til hver brønd for at opnå en endelig brøndkoncentration på 0,1 millimolar, 0,02 millimolar, 0,04 millimolar, 0,0008 millimolar, 0,00016 millimolær og 0,000032 millimolar.Forbered derefter brøndene sammen med brøndene, der indeholder den tomme og negative kontrol. Brøndene indeholdende geldanamycin tjener som den positive kontrol. Forbered pladerne med 96 brønde og forbered en separat brønd til de forbindelser, der viser absorbans ved 620 nanometer for at registrere absorbansen ved denne bølgelængde.Vis ikke et separat hul for geldanamycin, da geldanamycin ikke viser absorbans ved 620 nanometer for den koncentration, der anvendes i dette assay. Opsæt analysebrønde ved at tilføje ultrarent vand til hver brønd. Derefter tilsættes den nødvendige mængde analysebuffer og en sammensat opløsning, såsom geldanamycinopløsning.Tilsæt Hsp90 til de relevante huller, og ryst pladerne i to minutter på en pladeryster ved stuetemperatur. Tilsæt fire mikroliter ATP-opløsning ved hjælp af en flerkanalspipette. Pak pladen ind i aluminiumsfolie og ryst i to minutter på en pladeryster ved stuetemperatur ved 200 o / min.Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i tre timer. Stop reaktionen ved at tilsætte 20 mikroliter malachitgrønt reagens i samme rækkefølge som ATP ved hjælp af en flerkanalpipette og inkubere i 15 minutter ved stuetemperatur. Endelig måles pladens absorbans ved 620 nanometer i en pladelæser.Derudover tilsættes plade A 90 mikroliter analysebuffer i hvert hul. Derudover tilsættes plade B 90 mikroliter buffer med Hsp90 i hvert hul. Derudover tilsættes plade C 90 mikroliter ATP, og derudover tilsættes plade D 90 mikroliter malachitgrønt reagens i hvert hul.Brug et automatiseret flerkanals dispenseringssystem til at overføre 40 mikroliter opløsning fra hver brønd med tilsætningsplade A til hovedplade en og to og plade B til hovedplade tre og fire. Overfør 20 mikroliter af opløsningen fra hvert hul i den sammensatte plade til hovedplader en, hovedplader to, hovedplader tre og hovedplader fire. Ryst pladerne i et minut i en ryster ved 200 o / min.Overfør 20 mikroliter af opløsningen fra hver brønd på tilsætningspladerne C til hovedpladerne en, to, tre og fire. Ryst pladerne i et minut i en ryster ved 200 o / min. Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius i tre timer, og overfør derefter 20 mikroliter malachitgrønt reagens fra tilsætningsplade D til brøndene på hovedplader en, to, tre og fire.Efter en 15-minutters inkubation ved stuetemperatur måles pladens absorbans ved 620 nanometer i en pladelæser. Strukturen af malachitgrøn og reaktionerne af malachitgrønt reagens A med frit fosfat og den efterfølgende reaktion med reagens B er vist her. Et standardplot for standardfosfatkoncentration er repræsenteret i denne figur.Her repræsenterer x-aksen den frie fosfat- eller pi-koncentration i mikromolar, og absorbansen ved 620 nanometer er afbildet på y-aksen. Fejlbjælkerne repræsenterer afvigelsen mellem de to stikprøvenumre. Den procentvise ATPase-aktivitet anvendes til at måle geldanamycins dosisafhængige hæmning af proteinet.Det blev observeret, at geldanamycin hæmmede proteinet på en dosisafhængig måde med en IC50-værdi på 0,85 mikromolar. Her er hvert punkt et gennemsnit af to bestemmelser. Farveudviklingen i hovedplade en efter tilsætning af det malachitgrønne middel er vist på dette billede.Den lyserøde farve i A11-brønden skyldes den sammensatte farve. Tilsvarende er farveudviklingen i hovedplade to vist her. Den lyserøde farve i A11-brønden skyldes forbindelsens farvede natur.Farveudviklingen efter tilsætning af det malachitgrønne reagens i hovedplade tre og i hovedplade fire er vist her. Tilsætningen af ATP og malachitgrønt reagens med samme tidsinterval til hver brønd er en vigtig ting at huske, når du forsøger denne procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Udarbejdelse og levering af Protein Mikrokrystaller i lipide Cubic fase for Serial Femtosekund Krystallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokrystallografi af proteinkrystaller og<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraktion

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning af Protein niveauer på tværs af væv og udvikling ved hjælp af standardiserede kvantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-gennemløb tilpasning af NADH-koblede ATPase assay til screening små molekyle hæmmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Vurdering af cellulær oxidation ved hjælp af et subcellulært rum-specifikt redox-følsomt grønt fluorescerende protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanopartikler System for Membran Protein-Protein Interaktion Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown-analyse kombineret med co-ekspression i bakterieceller som et tidseffektivt værktøj til test af udfordrende protein-protein-interaktioner

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Development of a Click-Based Assay for Screening HAT1 Enzyme Activity

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening

En acetyl-klik kemi assay til måling af histon acetyltransferase 1 acetylering

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...