Name: malachite green assay for the discovery of heat-shock protein 90 inhibitors
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מלגות המחקר של קוריאה (KRF), עמית פוסט-דוקטורט של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), במימון משרד המדע והתקשוב (NRF-2019H1D3A1A01102952). המחברים מודים למענק KIST ולמענק משרד האוקיינוסים והדיג מספר 2MRB130 על מתן סיוע כספי לפרויקט זה.

1. בדיקת מלכיט ירוק בקנה מידה מעבדתי
<ol><li>הכנת מאגר בדיקה<ol><li>הכינו את מאגר הבדיקה, בהתאם להרכב ולהכנה המוצגים בטבלה 1.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תקני פוספט<ol><li>יש להשתמש בתקן פוספט 1 mM, המסופק בערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיט (מאוחסן ב- 4 °C).</li>
		<li>פיפטה 40 μL של 1 mM פוספט סטנדרטי ב 960 μL של מ?...

<ol>
	<li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone.">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li><li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis:+emerging+mechanistic+insights.">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li><li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP90+for+cancer+therapy.">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li><li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents.">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li><li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics.">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).</li><li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging.">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li><li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery.">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li><li>Park, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90,+Grp94,+and+TRAP1.">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental &amp; molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li><li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pimitespib:+first+approval.">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li><li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins:+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation.">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90:+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation.">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90.">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90&#945;+inhibitors.">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90&#945; inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90&#945;+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure.">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90&#945; inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90&#945;+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors.">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90&#945; docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li><li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors:+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead.">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate:+mechanism+and+application.">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li><li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+docking+study,+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors.">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors.">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein &amp; Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li><li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers.">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li><li>Mahapatra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+90+(Hsp90)+inhibitory+potentials+of+some+chalcone+compounds+as+novel+anti-proliferative+candidates.">Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates.</a> Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).</li><li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90:+enabler+of+cancer+adaptation.">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li><li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis,+prognosis,+metabolism+and+treatment.">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).</li><li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Hsp90&#946;-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition.">The development of Hsp90&#946;-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li><li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor.">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).</li><li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells.">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li><li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo.">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li><li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases.">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 221, 107747 (2021).</li><li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90.">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li><li>Opali&#324;ska, M., Ja&#324;ska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAA+proteases:+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis.">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163 (2018).</li><li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+therapeutic+potential,+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones.">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li><li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase,+substrate+translocation+and+proteolytic+activity.">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li></ol>

Hsp90 הוא יעד משמעותי לגילוי מולקולות תרופות אנטי-סרטניות חדשניות. מאז התבססה יכולת הטיפול התרופתי שלה בשנת 1994,10, 18 מולקולות הגיעו לניסויים קליניים. כיום, שבע מולקולות נמצאות בשלבים שונים של ניסויים קליניים, לבדן או בשילוב22. כל המולקולות הקטנות הללו הן מעכבי קשירת AT...

חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא מלווה מולקולרי השומר על יציבות החלבונים האחראים להתפתחות והתקדמות סרטן. בנוסף, חלבונים האחראים על התפתחות עמידות לחומרים אנטינאופלסטיים הם גם לקוחות של Hsp901. Hsp90 מתבטא יתר על המידה בכל סוגי התאים הסרטניים (>90% מהחלבונים התאיים), בהשוואה לתאים רגילים שבהם הוא עשוי להוות פחות מ-2% מכלל החלבונים. יתר על כן, Hsp90 של תאים סרטניים שוכן בקומפלקס עם מלווים משותפים, בעוד שבתא רגיל הוא נמצא בעיקר במצב חופשי, לא מורכב 2,3. בשנים האחרונות, מספר מעכבי Hsp90 הוכחו כבעלי השפעות סנוליטיות במחקרי in vitro ו-in vivo, שם הם שיפרו באופן משמעותי את תוחלת החיים של עכברים 4,5,6. כל הממצאים הנ"ל מאששים את העובדה שמעכבי Hsp90 יכולים להיות יעילים במספר סוגי סרטן, עם פחות תופעות לוואי וסיכויים מופחתים לפתח עמידות. פונקציית הליווי של Hsp90 מושגת על ידי קשירת ATP בתחום N-terminal של Hsp90 והידרוליזה שלו ל-ADP ולפוספט חופשי7. מולקולות קטנות שנקשרות באופן תחרותי לכיס קשירת ה-ATP של Hsp90 נמצאו כמדכאות בהצלחה את השפעת הליווי של החלבון. נכון להיום, זו נותרה האסטרטגיה הטובה ביותר עבור עיכוב Hsp90, אשר נתמך על ידי העובדה כי מעכבים כאלה הגיעו לניסויים קליניים8. אחד מהם, Pimitespib, אושר ביפן לטיפול בגידול סטרומה במערכת העיכול (GIST) ביוני 20229. זהו מעכב Hsp90 הראשון שאושר מאז הוקמה יכולת הטיפול התרופתי של המלווה בשנת 199410.
בדיקת מלכיט ירוק היא הליך פשוט, רגיש, מהיר וזול לאיתור פוספט אנאורגני, המתאים לאוטומציה ולסינון תפוקה גבוהה (HTS) של תרכובות כנגד היעד הרצוי11. הבדיקה שימשה בהצלחה לסינון מעכבי Hsp90 בתצורות מעבדה קטנות, כמו גם ב- HTS 12,13,14,15,16,17. הבדיקה משתמשת בשיטה קולורימטרית הקובעת את הפוספט האי-אורגני החופשי שנוצר עקב פעילות ATPase של Hsp90. הבסיס לכימות הזה הוא היווצרות קומפלקס פוספוהומוליבדט בין פוספט חופשי למוליבדן, אשר לאחר מכן מגיב עם ירוק מלכיט ליצירת צבע ירוק (איור 1). היווצרות צבע מהירה זו נמדדת על ספקטרופוטומטר, או על קורא לוחות, בין 600-660 ננומטר18,19.
בפרוטוקול הנוכחי מתואר ההליך לביצוע בדיקה ירוקה מלכיט עם שמרים Hsp90 וזיהוי עוקב של מעכבים נגד המלווה. מולקולת המוצר הטבעית, geldanamycin (GA), שבה נקבעה לראשונה יכולת התרופה של Hsp90, נלקחה כמעכב אותנטי10. HTS הפך לחלק בלתי נפרד מתוכנית גילוי התרופות הנוכחית, בשל זמינותן של מספר רב של מולקולות לבדיקה. טכניקה זו קיבלה משמעות רבה יותר בשנתיים האחרונות בגלל הצורך הדחוף בייעוד מחדש של תרופות לטיפול בזיהום Covid-1920,21. לכן, מוצג מתווה מפורט ל-HTS של מולקולות כנגד חלבון שמרים Hsp90 על ידי אימוץ שיטת הבדיקה הירוקה מלכיט.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1M Magnesium chloride solution in water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Potassium chloride solution in water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FX laboratory automation workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds 3-96</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geldanamycin, 99% (HPLC), powder</td>
			<td>AK Scientific, Inc.</td>
			<td>V2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite Green Phosphate Assay&#160; Assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAK307-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek Instruments, Inc.</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT multi-plate reader</td>
			<td>Biotek Instruments, Inc.</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93313-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Hsp90</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

malachite green assay for the discovery of heat-shock protein 90 inhibitors

חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא מטרה אנטי-סרטנית מבטיחה בגלל השפעתו הנלווית על חלבונים אונקוגניים מרובים. הפעילות של Hsp90 תלויה ביכולתו לבצע הידרוליזה של אדנוזין טריפוספט (ATP) לאדנוזין דיפוספט (ADP) ולפוספט חופשי. פעילות ATPase של Hsp90 קשורה לפונקציית הליווי שלו; ATP נקשר לתחום N-terminal של Hsp90, ושיבוש הקשירה שלו נמצא כאסטרטגיה המוצלחת ביותר בדיכוי פונקציית Hsp90. ניתן למדוד את פעילות ה-ATPase על ידי בדיקת מלכיט ירוק קולורימטרי, הקובעת את כמות הפוספט החופשי שנוצר על ידי הידרוליזה של ATP. כאן מתואר הליך לקביעת פעילות ATPase של שמרים Hsp90 באמצעות ערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיט. יתר על כן, הוראות מפורטות לגילוי מעכבי Hsp90 על ידי נטילת geldanamycin כמעכב אותנטי מסופק. לבסוף, נדון היישום של פרוטוקול בדיקה זה באמצעות סינון בתפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות מעכבות כנגד שמרים Hsp90.

תוצאות הבדיקה מפורשות במונחים של ספיגה עקב ריכוז יוני פוספט חופשי. ספיגה על ידי פוספט חופשי עקב הידרוליזה ATP על ידי שמרים Hsp90 ב 620 ננומטר נחשב 100% פעילות ATPase, או אפס אחוז עיכוב חלבון. עיכוב החלבון מוביל להפסקת הידרוליזה של ATP (פחות פוספט חופשי). אשר באה לידי ביטוי במונחים של ירידה בספיגה ב 620 ננו...

Watch this Scientific Journal Video about Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors at JoVE.com

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

פרוטוקול הבדיקה הירוק של מלכיט הוא שיטה פשוטה וחסכונית לגילוי מדכאי חלבון הלם חום 90 (Hsp90), כמו גם תרכובות מעכבות אחרות נגד אנזימים תלויי ATP.

בדיקת מלכיט ירוק לגילוי מעכבי חלבון הלם חום 90

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

פרוטוקול זה יסייע בקביעת הפעילות של חלבוני ATPase על ידי מדידת הפוספט החופשי הנובע מהידרוליזה של ATP על ידי החלבונים. בדיקת מלכיט ירוק היא הליך פשוט, רגיש, מהיר וזול לאיתור פוספט אנאורגני. הוא מתאים לאוטומציה ולסינון בתפוקה גבוהה של תרכובות כנגד מטרתו.טכניקה זו תמלא תפקיד חשוב בגילוי מהיר של מעכבים נגד חלבון Hsp90, שהוא מטרה אנטי סרטנית חשובה. כדי להתחיל, פיפטה 40 מיקרוליטר של תקן פוספט מילימולרי אחד ב 960 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד כדי לקבל תמיסת פוספט 40 מיקרומולרית. הוסף פתרון זה בהתאם להוראות היצרן כדי ליצור דילול סדרתי של פוספט מ 0-עד 40-micromolar.לאחר מכן, השתמשו בשמונה מיקרוליטרים של שמרים Hsp90 לפעילות ATPase מדידה. הוסף מגיב ירוק מלכיט לבקרה הריקה ולבקרה החיובית, ובדוק את הפרש הצפיפות האופטית בין הבקרה הריקה לבקרה החיובית לאחר שהתוספת היא לפחות 0.5 וקטנה מ- 1. כדי להכין ATP, להעביר מיליגרם אחד של ATP לבקבוקון המכיל 453.39 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד כדי לקבל תמיסת מלאי ארבעה מילימולרי.הכינו את ה-ATP טרי, מכיוון שהוא יכול לבצע הידרוליזה ספונטנית לאורך זמן. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי ATP לכל באר כדי לתת ריכוז באר סופי של 0.2 מילימולר. הוסף ATP כמרכיב האחרון לתגובה באמצעות פיפטה רב ערוצית כך שכל התגובות יתחילו בו זמנית.לאחר מכן, להכין מלאי 10 מילימולרי של geldanamycin על ידי המסת מיליגרם אחד ב 178.37 מיקרוליטר של DMSO. באמצעות תמיסת המלאי, הכן תמיסה של 4 מילימולר, 0.8 מילימולר, 0.16 מילימולר, 0.032 מילימולר, 0.0064 מילימולרית ו- 0.00128 מילימולרית ב- DMSO על ידי דילול טורי. הוסף שני מיקרוליטרים של תמיסות מלאי אלה לכל באר כדי לקבל ריכוז באר סופי של 0.1 מילימולרי, 0.02 מילימולרי, 0.04 מילימולרי, 0.0008 מילימולרי, 0.00016 מילימולרי ו- 0.000032 מילימולרי.לאחר מכן, הכינו את הבארות יחד עם הבארות המכילות את הבקרה הריקה והשלילית. הבארות המכילות geldanamycin משמשות כבקרה חיובית. הכינו את לוחות 96 הקידוחים והכינו באר נפרדת לתרכובות המראות ספיגה של 620 ננומטר כדי לרשום את הבליעה באורך גל זה.אין להראות באר נפרדת עבור geldanamycin, כמו geldanamycin אינו מראה ספיגה ב 620 ננומטר עבור הריכוז המשמש בבדיקה זו. הגדר בארות בדיקה על ידי הוספת מים טהורים במיוחד לכל באר. לאחר מכן, הוסף את הכמות הנדרשת של מאגר הבדיקה ותמיסה מורכבת כגון תמיסת geldanamycin.מוסיפים את Hsp90 לבארות המתאימות ומנערים את הצלחות במשך שתי דקות על שייקר צלחות בטמפרטורת החדר. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של פתרון ATP באמצעות פיפטה רב ערוצית. עוטפים את הצלחת ברדיד אלומיניום ומנערים במשך שתי דקות על שייקר בטמפרטורת החדר ב-200 סל"ד.דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות למשך שלוש שעות. עצור את התגובה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של מגיב ירוק מלכיט באותו סדר כמו ATP באמצעות פיפטה רב ערוצית לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, למדוד את הספיגה של הצלחת ב 620 ננומטר בקורא לוחות.בנוסף צלחת A, להוסיף 90 מיקרוליטר של חיץ assay בכל באר. בנוסף צלחת B, להוסיף 90 מיקרוליטר של חיץ עם Hsp90 בכל באר. בנוסף צלחת C, להוסיף 90 מיקרוליטר של ATP, ובנוסף צלחת D להוסיף 90 מיקרוליטר של מגיב ירוק מלכיט בכל באר.השתמש במערכת ניפוק רב-ערוצית אוטומטית כדי להעביר 40 מיקרוליטר של תמיסה מכל באר של צלחת חיבור A ללוחות ראשיים אחד ושניים, וצלחת B לצלחת הראשית שלוש וארבע. מעבירים 20 מיקרוליטר של התמיסה מכל באר של הצלחת המורכבת לצלחות ראשיות אחת, צלחות ראשיות שתיים, צלחות ראשיות שלוש וצלחות ראשיות ארבע. נערו את הצלחות במשך דקה אחת בשייקר ב-200 סל"ד.מעבירים 20 מיקרוליטר של התמיסה מכל באר של לוחות התוספת C ללוחות הראשיים אחת, שתיים, שלוש וארבע. נערו את הצלחות במשך דקה אחת בשייקר ב-200 סל"ד. דוגרים על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות ולאחר מכן מעבירים 20 מיקרוליטר של מגיב ירוק מלכיט מצלחת D לבארות של לוחות ראשיים אחת, שתיים, שלוש וארבע.לאחר דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, מדדו את ספיגת הצלחת ב-620 ננומטר בקורא לוחות. המבנה של מלכיט ירוק והתגובות של מגיב ירוק מלכיט A עם פוספט חופשי והתגובה הבאה עם מגיב B מוצגים כאן. תרשים סטנדרטי לריכוז פוספט סטנדרטי מיוצג באיור זה.כאן, ציר ה-x מייצג את ריכוז הפוספט החופשי או ה-pi במיקרומולרית, והספיגה ב-620 ננומטר מתוארת על ציר ה-y. קווי השגיאה מייצגים את הסטייה בין שני מספרי המדגם. אחוז פעילות ATPase משמש למדידת עיכוב תלוי מינון של החלבון על ידי geldanamycin.נצפה כי geldanamycin עיכב את החלבון באופן תלוי מינון עם ערך IC50 של 0.85-micromolar. כאן, כל נקודה היא ממוצע של שתי קביעות. התפתחות הצבע בלוח הראשי אחד לאחר הוספת הסוכן הירוק מלכיט מוצג בתמונה זו.הצבע הוורוד בבאר A11 נובע מהצבע המורכב. באופן דומה, התפתחות הצבע בלוח הראשי השני מוצגת כאן. הצבע הוורוד בבאר A11 נובע מאופיו הצבעוני של המתחם.התפתחות הצבע לאחר הוספת מגיב ירוק מלכיט בצלחת הראשית שלוש ובצלחת הראשית ארבע מוצגת כאן. תוספת של ATP ו malachite מגיב ירוק באותו מרווח זמן לכל באר הוא דבר חשוב לזכור כאשר מנסים הליך זה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו<em&gt; בסולו</em&gt; השתברות

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Development of a Click-Based Assay for Screening HAT1 Enzyme Activity

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening

בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...