Name: malachite green assay for the discovery of heat-shock protein 90 inhibitors
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors at JoVE.com

Denna studie stöddes av Korea Research Fellowship (KRF) -programmet, postdoktor vid National Research Foundation of Korea (NRF), finansierat av ministeriet för vetenskap och IKT (NRF-2019H1D3A1A01102952). Författarna är tacksamma för KIST intramural grant och Ministry of Oceans and Fisheries grant nummer 2MRB130 för att ge ekonomiskt stöd till detta projekt.

1. Laboratorieskala malakitgrön analys
<ol><li>Beredning av analysbuffert<ol><li>Bered analysbufferten enligt den sammansättning och beredning som presenteras i tabell 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Framställning av fosfatstandarder<ol><li>Använd 1 mM fosfatstandard, som tillhandahålls i malakitgrönt analysfosfatanalyskit (lagrat vid 4 °C).</li>
		<li>Pipettera 40 μL 1 mM fosfatstandard i 960 μL ultrarent vatten för erhållande av 40 μM fosfatlösning (förblandningslösning). Til...

<ol>
	<li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone.">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li><li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis:+emerging+mechanistic+insights.">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li><li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP90+for+cancer+therapy.">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li><li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents.">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li><li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics.">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).</li><li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging.">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li><li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery.">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li><li>Park, H. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90,+Grp94,+and+TRAP1.">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental &amp; molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li><li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pimitespib:+first+approval.">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li><li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins:+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation.">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li><li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity.">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li><li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90:+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation.">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90.">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90&#945;+inhibitors.">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90&#945; inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90&#945;+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure.">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90&#945; inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li><li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90&#945;+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors.">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90&#945; docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li><li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors:+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead.">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate:+mechanism+and+application.">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li><li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+docking+study,+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors.">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors.">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein &amp; Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li><li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers.">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li><li>Mahapatra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+protein+90+(Hsp90)+inhibitory+potentials+of+some+chalcone+compounds+as+novel+anti-proliferative+candidates.">Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates.</a> Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).</li><li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90:+enabler+of+cancer+adaptation.">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li><li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis,+prognosis,+metabolism+and+treatment.">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).</li><li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Hsp90&#946;-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition.">The development of Hsp90&#946;-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li><li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor.">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).</li><li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells.">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li><li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo.">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li><li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases.">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 221, 107747 (2021).</li><li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90.">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li><li>Opali&#324;ska, M., Ja&#324;ska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAA+proteases:+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis.">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163 (2018).</li><li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+therapeutic+potential,+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones.">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li><li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase,+substrate+translocation+and+proteolytic+activity.">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li></ol>

Hsp90 är ett viktigt mål för upptäckten av nya läkemedelsmolekyler mot cancer. Sedan dess läkemedelsförmåga etablerades 199410, 18 molekyler har nått kliniska prövningar. För närvarande befinner sig sju molekyler i olika faser av kliniska prövningar, antingen ensamma eller i kombination22. Alla sådana små molekyler är N-terminala ATP-bindande hämmare. De andra sätten att hämma chaperonen (C-terminala hämmare, mellandomänhämmare) har inte gått lika sna...

Värmechockprotein 90 (Hsp90) är en molekylär chaperon som upprätthåller stabiliteten hos proteiner som är ansvariga för utveckling och progression av cancer. Dessutom är proteiner som är ansvariga för utvecklingen av resistens mot antineoplastiska medel också kunder av Hsp901. Hsp90 överuttrycks allestädes närvarande i alla cancercelltyper (>90% av cellulära proteiner), jämfört med normala celler där det kan utgöra mindre än 2% av det totala proteinet. Dessutom finns Hsp90 av cancerceller i ett komplex med co-chaperoner, medan det i en normal cell huvudsakligen förekommer i ett fritt, okomplext tillstånd 2,3. Under de senaste åren har flera Hsp90-hämmare visat sig ha senolytiska effekter i in vitro- och in vivo-studier, där de signifikant har förbättrat livslängden hos möss 4,5,6. Alla ovannämnda fynd bekräftar det faktum att Hsp90-hämmare kan vara effektiva i flera cancertyper, med färre biverkningar och minskad risk att utveckla resistens. Chaperoneringsfunktionen för Hsp90 åstadkoms genom att binda ATP vid N-terminaldomänen för Hsp90 och hydrolysera den till ADP och fritt fosfat7. Små molekyler som kompetitivt binder till ATP-bindningsfickan av Hsp90 visade sig framgångsrikt undertrycka proteinets chaperoningseffekt. Hittills är detta fortfarande den bästa strategin för Hsp90-hämning, vilket stöds av det faktum att sådana hämmare har nått kliniska prövningar8. En av dem, Pimitespib, godkändes i Japan för behandling av gastrointestinal stromacellstumör (GIST) i juni 20229. Detta är den första Hsp90-hämmaren som godkänts sedan chaperonens drogbarhet etablerades 199410.
Den malakitgröna analysen är en enkel, känslig, snabb och billig procedur för detektion av oorganiskt fosfat, lämplig för automatisering och screening med hög genomströmning (HTS) av föreningar mot dess önskade mål11. Analysen har framgångsrikt använts för screening av Hsp90-hämmare i små laboratorieskalor, liksom i en HTS 12,13,14,15,16,17. Analysen använder en kolorimetrisk metod som bestämmer det fria oorganiska fosfatet bildat på grund av ATPas-aktiviteten hos Hsp90. Grunden för denna kvantifiering är bildningen av ett fosfomolybdatkomplex mellan fritt fosfat och molybden, som därefter reagerar med malakitgrön för att generera en grön färg (figur 1). Denna snabba färgbildning mäts på en spektrofotometer, eller på en plattläsare, mellan 600-660 nm18,19.
I detta protokoll beskrivs förfarandet för att utföra en malakitgrön analys med jäst Hsp90 och efterföljande identifiering av hämmare mot chaperonen. Den naturliga produktmolekylen, geldanamycin (GA), med vilken läkemedelsbarheten för Hsp90 först fastställdes, togs som en autentisk hämmare10. HTS har blivit en integrerad del av det nuvarande läkemedelsupptäcktsprogrammet på grund av tillgången på ett stort antal molekyler för testning. Denna teknik har fått större betydelse under de senaste 2 åren på grund av det akuta behovet av återanvändning av läkemedel för behandling av Covid-19-infektion20,21. Därför presenteras en detaljerad översikt för HTS av molekyler mot jäst Hsp90-protein genom att anta malakitgrön analysmetod.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1M Magnesium chloride solution in water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Potassium chloride solution in water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60142-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek FX laboratory automation workstation</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds 3-96</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geldanamycin, 99% (HPLC), powder</td>
			<td>AK Scientific, Inc.</td>
			<td>V2064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite Green Phosphate Assay&#160; Assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MAK307-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT</td>
			<td>Biotek Instruments, Inc.</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT multi-plate reader</td>
			<td>Biotek Instruments, Inc.</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93313-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Hsp90</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

malachite green assay for the discovery of heat-shock protein 90 inhibitors

Värmechockprotein 90 (Hsp90) är ett lovande anticancermål på grund av dess chaperoning effekt på flera onkogena proteiner. Aktiviteten hos Hsp90 är beroende av dess förmåga att hydrolysera adenosintrifosfat (ATP) till adenosindifosfat (ADP) och fritt fosfat. ATPas-aktiviteten hos Hsp90 är kopplad till dess chaperoningsfunktion; ATP binder till N-terminaldomänen för Hsp90, och att störa dess bindning visade sig vara den mest framgångsrika strategin för att undertrycka Hsp90-funktionen. ATPas-aktiviteten kan mätas med en kolorimetrisk malakitgrön analys, som bestämmer mängden fritt fosfat bildat genom ATP-hydrolys. Här beskrivs ett förfarande för bestämning av ATPas-aktiviteten hos jäst Hsp90 med hjälp av malakitgrönt fosfatanalyssats. Vidare ges detaljerade instruktioner för upptäckten av Hsp90-hämmare genom att ta geldanamycin som en autentisk hämmare. Slutligen diskuteras tillämpningen av detta analysprotokoll genom high-throughput screening (HTS) av inhibitormolekyler mot jäst Hsp90.

Resultaten av analysen tolkas i termer av absorbans på grund av fri fosfatjonkoncentration. Absorbansen med fritt fosfat på grund av ATP-hydrolys av jästen Hsp90 vid 620 nm anses vara 100% ATPas-aktivitet eller nollprocentig proteinhämning. Hämningen av protein leder till att ATP-hydrolys upphör (mindre fritt fosfat). vilket återspeglas i termer av minskad absorbans vid 620 nm.
Resultat av malakitgrön analys i labskala Standarddiagrammet för fosfatstandarden visas ...

Watch this Scientific Journal Video about Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors at JoVE.com

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

Malakitgrönt analysprotokoll är en enkel och kostnadseffektiv metod för att upptäcka värmechockprotein 90 (Hsp90) suppressorer, liksom andra inhibitorföreningar mot ATP-beroende enzymer.

Malakitgrön analys för upptäckt av värmechockprotein 90-hämmare

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

Detta protokoll kommer att hjälpa till vid bestämning av aktiviteten för ATPas-proteiner genom att mäta det fria fosfatet som härrör från ATP-hydrolys av proteinerna. Den malakitgröna analysen är ett enkelt, känsligt, snabbt och billigt förfarande för detektion av oorganiskt fosfat. Den är lämplig för automatisering och screening med hög genomströmning av föreningar mot sitt mål.Denna teknik kommer att spela en viktig roll i den snabba upptäckten av hämmare mot Hsp90-proteinet, vilket är ett viktigt mål mot cancer. För att börja, pipettera 40 mikroliter en-millimolär fosfatstandard i 960 mikroliter ultrarent vatten för att erhålla 40-mikromolär fosfatlösning. Tillsätt denna lösning enligt tillverkarens instruktioner för att bilda en serieutspädning av fosfat från 0 till 40 mikromolar.Använd sedan åtta mikroliter jäst Hsp90 för mätbar ATPas-aktivitet. Tillsätt malakitgrönt reagens till blindprovet och den positiva kontrollen och kontrollera att skillnaden i optisk densitet mellan blindprovet och den positiva kontrollen efter tillsatsen är minst 0,5 och mindre än 1. För att förbereda ATP, överför ett milligram ATP till en injektionsflaska innehållande 453,39 mikroliter ultrarent vatten för erhållande av fyra millimolar stamlösning.Förbered ATP färskt, eftersom det spontant kan hydrolysera över tiden. Tillsätt fyra mikroliter ATP-stamlösning till varje brunn för att ge en slutlig brunnskoncentration på 0,2 millimolar. Tillsätt ATP som den sista komponenten till reaktionen med en flerkanalig pipett så att alla reaktioner startar samtidigt.Därefter förbereda ett 10-millimolärt lager av geldanamycin genom att lösa ett milligram i 178,37 mikroliter DMSO. Bereda med stamlösningen 4 millimolar, 0,8 millimolär, 0,16 millimolär, 0,032 millimolär, 0,0064 millimolär och 0,00128 millimolär lösning i DMSO genom serieutspädning. Tillsätt två mikroliter av dessa stamlösningar till varje brunn för att erhålla en slutlig brunnskoncentration av 0,1 millimolar, 0,02 millimolar, 0,04 millimolar, 0,0008 millimolar, 0,00016 millimolar och 0,000032 millimolar.Förbered sedan brunnarna tillsammans med brunnarna som innehåller den tomma och negativa kontrollen. Brunnarna som innehåller geldanamycin fungerar som positiv kontroll. Förbered 96-brunnsplattorna och förbered en separat brunn för föreningarna som visar absorbans vid 620 nanometer för att registrera absorbansen vid denna våglängd.Visa inte en separat brunn för geldanamycin, eftersom geldanamycin inte visar absorbans vid 620 nanometer för den koncentration som används i denna analys. Ställ in analysbrunnar genom att tillsätta ultrarent vatten till varje brunn. Tillsätt sedan den erforderliga mängden analysbuffert och en sammansatt lösning såsom geldanamycinlösning.Tillsätt Hsp90 till lämpliga brunnar och skaka plattorna i två minuter på en plattskakare vid rumstemperatur. Tillsätt fyra mikroliter ATP-lösning med en flerkanalig pipett. Slå in plattan i aluminiumfolie och skaka i två minuter på en plattskakare vid rumstemperatur vid 200 rpm.Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i tre timmar. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 20 mikroliter malakitgrönt reagens i samma ordning som ATP med en flerkanalig pipett och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Slutligen mäta plattans absorbans vid 620 nanometer i en plattläsare.Dessutom platta A, tillsätt 90 mikroliter analysbuffert i varje brunn. Dessutom platta B, tillsätt 90 mikroliter buffert med Hsp90 i varje brunn. Dessutom platta C, tillsätt 90 mikroliter ATP, och dessutom platta D tillsätt 90 mikroliter malakitgrönt reagens i varje brunn.Använd ett automatiserat flerkanaligt doseringssystem för att överföra 40 mikroliter lösning från varje brunn med tillsatsplatta A till huvudplattor ett och två och platta B till huvudplatta tre och fyra. Överför 20 mikroliter av lösningen från varje brunn på föreningsplattan till huvudplattorna en, huvudplattorna två, huvudplattorna tre och huvudplattorna fyra. Skaka plattorna i en minut i en shaker vid 200 rpm.Överför 20 mikroliter av lösningen från varje brunn på tillsatsplattorna C till huvudplattorna ett, två, tre och fyra. Skaka plattorna i en minut i en shaker vid 200 rpm. Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius i tre timmar och överför sedan 20 mikroliter malakitgrönt reagens från tillsatsplatta D till brunnarna på huvudplattorna ett, två, tre och fyra.Efter en 15-minuters inkubation vid rumstemperatur, mät plattans absorbans vid 620 nanometer i en plattläsare. Strukturen av malakitgrönt och reaktionerna av malakitgrönt reagens A med fritt fosfat och den efterföljande reaktionen med reagens B visas här. En standardplot för standardfosfatkoncentration representeras i denna figur.Här representerar x-axeln det fria fosfatet eller pi-koncentrationen i mikromolar, och absorbansen vid 620 nanometer avbildas på y-axeln. Felstaplarna representerar avvikelsen mellan de två provnumren. Den procentuella ATPas-aktiviteten används för att mäta den dosberoende hämningen av proteinet av geldanamycin.Det observerades att geldanamycin hämmade proteinet på ett dosberoende sätt med ett IC50-värde på 0,85-mikromolar. Här är varje punkt ett medelvärde av två bestämningar. Färgutvecklingen i huvudplatta ett efter tillsats av det malakitgröna medlet visas i denna bild.Den rosa färgen i A11-brunnen beror på den sammansatta färgen. På samma sätt visas färgutvecklingen i huvudplatta två här. Den rosa färgen i A11-brunnen beror på föreningens färgade natur.Färgutvecklingen efter tillsats av det malakitgröna reagenset i huvudplatta tre och i huvudplatta fyra visas här. Tillsatsen av ATP och malakitgrönt reagens vid samma tidsintervall till varje brunn är en viktig sak att komma ihåg när du försöker denna procedur.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Mikrokristallografi av proteinkristaller och<em&gt; I Cellulo</em&gt; Diffraktion

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Bedömning av cellulär oxidation med hjälp av ett subcellulärt fackspecifikt Redox-sensitive green fluorescerande protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Inbyggt cellmembrannanopartiklar system för membranprotein-protein interaktionsanalys

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown-analys i kombination med samuttryck i bakterieceller som ett tidseffektivt verktyg för att testa utmanande protein-proteininteraktioner

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Development of a Click-Based Assay for Screening HAT1 Enzyme Activity

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening

En acetylklickkemianalys för att mäta histonacetyltransferas 1-acetylering

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...