Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) إلى S.B. تم إنتاج البيانات المستخدمة في هذا العمل (جزئيا) من خلال المرافق الفنية GenSeq التابعة لمعهد علوم التطور في مونبلييه بدعم من LabEx CeMEB ، وهو برنامج ANR "استثمارات المستقبل" (ANR-10-LABX-04-01).

يتطلب إعداد هذا البروتوكول معرفة دقيقة بنقطة الإدراج أو الحذف أو الانعكاس أو الازدواجية داخل تسلسل الأجداد. عادة ما يتم الحصول على هذه المعلومات عن طريق تسلسل الجينوم الكامل (WGS) لعينات النقطة النهائية أو الوسيطة. في البروتوكول التالي ، يتم إعطاء المبدأ العام لحالة طفرة الإدراج لكل خطوة ، ...

<ol>
	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846 (2014).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence.">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li><li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability.">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li><li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria.">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li><li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature.">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li><li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria.">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).</li><li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer.">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects.">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li><li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2,000+generations.">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50,000-generation+experiment.">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li><li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

هنا ، اقترحنا طريقة فعالة من حيث التكلفة تسمح باتباع ديناميكيات أليلات SV التكيفية الناشئة في مجموعات التطور التجريبية. تجمع هذه الطريقة بين تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكلاسيكية والرحلان الكهربائي الشعري المتوازي الآلي ، مما يسمح بتحديد الكميات النسبية لألينتين. بمجرد إعداده ، ?...

المتغيرات الهيكلية (SVs) هي تغييرات في التسلسل الجيني ، تؤثر بشكل عام على 50 نقطة أساس أو أكثر. الفئات الأربع من SVs الموصوفة هي عمليات إدراج كبيرة وعمليات حذف كبيرة وانعكاسات وازدواجية. حتى وقت قريب ، تم تكريس المزيد من الاهتمام لمتغيرات النوكليوتيدات المفردة (SNVs) مقارنة بالمتغيرات الهيكلية ، من حيث تأثيراتها المظهرية ودورها كمحددات وراثية للمرض ، أو مساهمتها في التكيف. ربما يرجع ذلك إلى أنه من الأسهل اكتشاف SNVs والتنبؤ بآثارها المظهرية. ومع ذلك ، فإن تقنيات التسلسل العميق قصيرة وطويلة القراءة قد حسنت بقوة اكتشاف SVs ، على الأقل في الجينومات الفردية أو النسيلية1. في موازاة ذلك ، تم توصيف آثارها المظهرية بشكل أفضل ، وتم توثيق العديد من الأمثلة على آثارها كمحددات وراثية للأمراض البشرية 2,3 أو التكيف مع بيئة جديدة4.
عمليات الحذف والإدراج ، غالبا بسبب إدخالات العناصر الجينية المتنقلة (MGE) ، أكثر تعطيلا بكثير من تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) وتؤدي إلى طفرات إزاحة الإطار وتعديلات بنية البروتين. يؤدي الحذف وإدخال MGE داخل الجينات دائما تقريبا إلى تعطيل الجينات ، ويمكن أن يؤدي الإدراج في المناطق غير المشفرة إلى قمع أو تعبير تأسيسي للجينات المجاورة عندما تحتوي تسلسلات الإدراج (ISs) على تسلسلات المروج أو الإنهاء5. في حين أن خروج الجينات الأساسية يؤدي إلى آثار ضارة واضحة على اللياقة البكتيرية ، فإن فقدان الجينات غير الأساسية مفيد في بعض الحالات. وعلى الرغم من التكاليف المتأصلة في الازدواجية، فإنها يمكن أن تكون مفيدة أيضا، وتشارك في التكيف لأنها تؤدي إلى تغيير في جرعة الجينات؛ يمكن أن تكون الزيادة في نشاط بروتين معين مفيدة اعتمادا على الظروف6.
عادة ما تبدأ مجموعات التطور التجريبي الميكروبي بالحيوانات المستنسخة. هذا الغياب الأولي للتنوع الجيني ، جنبا إلى جنب مع خاصية "البيئة المغلقة" لأنابيب الاختبار ، يؤدي إلى إمكانات محدودة للغاية للتطور عن طريق اكتساب الجينات من خلال نقل الجينات الأفقية وإعادة التركيب. في هذه الظروف المحددة ، تكون المساهمة في تكييف عمليات الحذف والازدواجية وإدخال MGE داخل الجينوم مهمة بشكل خاص ؛ غالبا ما تتكيف البكتيريا من خلال طفرات فقدان الوظيفة (ويرجع ذلك أساسا إلى عمليات الحذف أو إدخال MGE) ، مما يؤثر على الجينات غير المفيدة في البيئات الاصطناعية المستقرة ، الغنية بالمغذياتفي كثير من الأحيان ، 7. في أطول تجربة لتطور الإشريكية القولونية ، كانت عمليات إدخال IS150 متكررة بشكل خاص بين المجموعات السكانية التي تطورت بعد 50000 جيل ، حيث تمثل عناصر IS 35٪ من الطفرات التي تصل إلى تردد عال في السكان الذين يحتفظون بمعدل طفرة نقطة أسلافهم8.
دراسات التطور وإعادة التسلسل تجمع بين التطور التجريبي وتقنيات التسلسل من الجيل التالي (NGS) للتحقيق في كيفية تكيف البكتيريا ، على المستويين الظاهري والجينومي ، مع الظروف والضغوط البيئية المختلفة ، مثل مصادر الكربون والطاقة المختلفة والمضادات الحيوية والإجهاد التناضحي9،10،11 . تحصل هذه الدراسات عادة على معلومات جينومية عن المجموعات السكانية المتطورة أو الحيوانات المستنسخة فقط عند نقطة النهاية التجريبية ، وفي بعض الحالات ، في عدد من النقاط الزمنية الوسيطة12،13،14. توفر هذه البيانات نظرة ثاقبة للجينات والمسارات المشاركة في التكيف مع بيئة معينة ، ولكنها نادرا ما تسمح للباحثين بمتابعة ديناميكيات الأليلات الناشئة والكاسحة بمرور الوقت.
تتمثل إحدى الطرق التي يجب اتباعها في هذه الديناميكيات في اختيار عدد محدود من الأليلات المنفصلة ذات الأهمية (بسبب وظيفة الجينات التي تؤثر عليها ، لأنها تكتسح بالتوازي في مجموعات سكانية مستقلة ، وما إلى ذلك) واستخدام تسلسل amplicon لتحديد نسبة الأليل ، وتجميع العديد من النقاط الزمنية في نفس تشغيل التسلسل15. تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لمتابعة ديناميكيات المتغيرات صغيرة الحجم (SNPs أو 1 bp indels) في16 و17 مجموعة تجريبية من الميكروبات. ومع ذلك ، في حالة إدخالات indels أو MGE الأكبر حجما ، فإن اختلاف حجم الأمبليكونات يؤدي إلى اختلافات كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يشوه العلاقة بين نسب القراءة والأليل . في بعض الحالات ، يكون فرق الحجم بين الأليلين أعلى من الطول الكلاسيكي للأخمبليون. هنا ، قمنا بإقران تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الثلاثي مع الرحلان الكهربائي الشعري المتوازي الآلي لتحديد التردد النسبي لأليل الإدخال بناء على تمييز الحجم. يسمح هذا النهج باستغلال النقاط الزمنية التجريبية غير المستغلة لتحديد ديناميات أليل طافر ناشئ ومتابعة تواتره للتثبيت أو الفقد ، بطريقة فعالة من حيث التكلفة. طبقنا هذه الطريقة لتتبع الأليلات الطافرة الناشئة ، التي تحورت من خلال إدخال IS10 ، مما يوفر للنمط الجيني المتحور نمطا ظاهريا مفرط التحور.
تتطلب هذه الطريقة أليلين مستهدفين باختلاف ≥5٪ في الحجم. أولا ، تم تصميم ثلاثة توائم أولية لإنتاج شظايا متشابهة الحجم ، والتي تشترك في التمهيدي المشترك. ثانيا ، يتم تحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويتم إنتاج منحنى معايرة باستخدام مزيج من النوع البري (WT) والحمض النووي الطافر. أخيرا ، يتم تضخيم العينات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويتم قياس التردد النسبي لكل أليل عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري الكمي المتوازي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

من المعروف الآن أن المتغيرات الهيكلية (SVs) (أي الحذف والإدراج والازدواجية والانقلابات) تلعب دورا مهما في تباين النمط الظاهري ، وبالتالي في عمليات مثل تحديد المرض أو التكيف مع بيئة جديدة. ومع ذلك ، فإن متغيرات النوكليوتيدات المفردة تحظى باهتمام أكبر بكثير من SVs ، ربما لأنها أسهل في اكتشافها ، ومن السهل التنبؤ بآثارها المظهرية. وقد أدى تطوير تكنولوجيات التسلسل العميق القصير والطويل القراءة إلى تحسين الكشف عن التسلسل العميق، ولكن التحديد الكمي لتواترها من بيانات التسلسل المجمع (poolseq) لا يزال معقدا ومكلفا من الناحية التقنية.
هنا ، نقدم طريقة بسيطة وغير مكلفة إلى حد ما ، والتي تسمح للباحثين بمتابعة ديناميات تردد أليل SV. كمثال على التطبيق ، نتبع تكرار إدخال تسلسل الإدراج (IS) في مجموعات التطور التجريبي للبكتيريا. تعتمد هذه الطريقة على تصميم ثلاثة توائم من الاشعال حول حدود المتغير الهيكلي ، بحيث تختلف الأمبليكونات الناتجة عن تضخيم النوع البري (WT) والأليلات المشتقة في الحجم بنسبة 5٪ على الأقل ، وأن كفاءة تضخيمها متشابهة. ثم يتم تحديد كمية كل amplicon عن طريق الكهربائي الشعري المتوازي وتطبيعها إلى منحنى المعايرة. يمكن توسيع هذه الطريقة بسهولة لتشمل التحديد الكمي لتواتر المتغيرات الهيكلية الأخرى (الحذف والازدواجية والانقلاب) ونهج التجميع التسلسلي للسكان الطبيعيين ، بما في ذلك مجموعات مسببات الأمراض داخل المريض.

باستخدام الحمض النووي المستخرج من استنساخ الأسلاف واستنساخ مفرط الحركة المعزول من مجموعة S2.11 عند الجيل 1000 ، أنشأنا منحنى المعايرة الموضح في الشكل 2. تم ربط النسب الطافرة الفعلية من خلطات الحمض النووي المعدة في المختبر والمقاسة بواسطة أداة الرحلان الكهربائي الشعري المتواز...

Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

لقد طورنا طريقة فعالة من حيث التكلفة لمتابعة ديناميكيات أليل تعدد أشكال النوكليوتيدات غير المفردة والتي يمكن تكييفها بسهولة مع أرشيفات التطور التجريبية المجمدة. اقترنت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الثلاثي مع الرحلان الكهربائي الشعري المتوازي الآلي لتحديد التردد النسبي لأليل الإدخال على مدار التطور التجريبي.

اتباع ديناميات المتغيرات الهيكلية في المجموعات السكانية المتطورة تجريبيا

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

كانت المتغيرات الهيكلية مثل الإدراج والحذف والازدواجية والانعكاسات في الماضي أكثر صعوبة في المتابعة تجريبيا ، ولا يمكن قياس تردداتها بدقة عن طريق تسلسل amplicon. نقدم هنا تقنية بسيطة فعالة من حيث التكلفة ، والتي تجمع بين تصميم التمهيدي الثلاثي والفصادة الكهربائية الشعرية المتوازية لمتابعة ترددات الأليل المتغيرة الهيكلية بمرور الوقت. تم تصميم هذه الطريقة لاستكمال تسلسل نقطة النهاية في التطور التجريبي وتتبع ترددات أليلات دي نوفو الناشئة.نأمل أن تفيد هذه الطريقة أيضا أولئك الذين يعملون مع بيانات مسببات الأمراض داخل المضيفين. ستوضح العملية جين هاميت ، مساعدة باحثة من مختبرنا. سيتم عرض الخطوات المختلفة للطرق في الحالة التي ينتج فيها الأليل المشتق عن إدخال IS10 في جين بكتيري يسمى mutS.قم أولا بتصميم زوج من الاشعال لتضخيم أمبليكون قصير على أليل النوع البري حول موقع الإدخال الطافر. صمم برايمر تمهيدي أمامي ثالث اثنين ضمن تسلسل الإدراج لإنتاج متغير حجم طفيف من النوع البري amplicon. ابدأ باستخراج الحمض النووي من مزارع على مدار 24 ساعة من النوع البري الثابت واستنساخ الأليل الطافر.بعد تحديد كمية الحمض النووي ، قم بتخفيف كل مستخلص DNA إلى خمسة نانوجرام لكل ميكرولتر بالماء. ثبت العينتين بنسبة 50/50. قم بإعداد تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على 10 نانوجرام من عينة الحمض النووي والبادئات والمزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل.بعد ذلك ، افصل منتج PCR عن طريق الرحلان الكهربائي ، باستخدام هلام أغاروز 2٪. يجب التحقق من اختلاف الحجم بين amplicons من النوع البري والمتحولة على الجل. للحصول على منحنى معايرة ، ابدأ بخلط الحمض النووي من النوع البري والحمض النووي الطافر بنسب مختلفة.تمييع منتجات PCR إلى 0.1 نانوغرام لكل ميكرولتر تركيز. لتحضير جل الفصل ، اخلطي الجل الطازج والصبغة. استبدل المخزن المؤقت للمدخل.ضع المخزن المؤقت للشطف في موقع الدرج الصحيح لأداة الرحلان الكهربائي الشعري المتوازي. أضف 22 ميكرولترا من علامة المخفف إلى آبار صفيحة بئر 96. أضف الآن ميكرولتر من منتجات PCR المخففة إلى كل عينة جيدا.إلى بئر واحد ، أضف سلما بحجم الحمض النووي من مجموعة عالية الحساسية ، يتراوح حجمها من واحد إلى 6000 زوج أساسي. ضع الصفيحة الدقيقة في أداة الرحلان الكهربائي الشعري المتوازي في تشغيل محدد على برنامج الجهاز. تحليل النتائج باستخدام برنامج تحليل البيانات.أولا ، حدد القمم بناء على حجمها المعروف. قم بقياس كل amplicon لإنتاج منحنى معايرة. وأخيرا، تحقق من قياس الكميات النسبية للأليلين قياسا صحيحا.ثم يتم استخدام منحنى المعايرة هذا لحساب كمية المتغيرات الهيكلية بعد تضخيم PCR والرحلان الكهربائي الشعري المتوازي. تتبع هذه النتائج التمثيلية إدخالا مدمرا في جين mutS. تؤدي الضربات القاضية و mutS إلى نمط ظاهري مفرط الطفرات ، مما يسمح للبكتيريا بأخذ عينات من طفرات أكثر من معدل الطفرة الأساسية.باستخدام الطريقة المقدمة ، تم تتبع تردد المتغير الهيكلي mutS عبر 1000 جيل. تم الكشف عن مسار غير رتيب للأليل الطافر الناشئ. تم اكتشاف الأليل الطافر لأول مرة في الجيل 680.ثم زاد الأليل بسرعة في التردد ، ليصل إلى 67 ٪ بحلول الجيل 713. ثم ركدت هذه الزيادة ، حيث زادت بنسبة 10٪ فقط على مدى الأجيال ال 53 التالية ، إلى 76٪ بشكل غير متوقع ، انخفض تردد الأليل الطافر من 76٪ إلى 49٪ على مدار 13 جيلا ، وبعد ذلك زاد إلى التثبيت. هذه الطريقة ستفيد أولئك الذين يعملون على التطور التجريبي.يسمح هذا البروتوكول للمستخدم بأخذ المحفوظات المجمدة واستكشاف المسارات التطورية التي لا يمكن ملاحظتها باستخدام بيانات تسلسل نقطة النهاية.

Research

JoVE Journal

Biology

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

مقابلة : HIV - 1 الحمض النووي الختان Proviral باستخدام تطورت Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching فحوصات (FRAP و FLIP) لقياس حيوية الكروماتين البروتين في الخلايا الحية الجذعية الجنينية

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

عزل Potentiated Hsp104 المتغيرات عن طريق الخميرة Proteinopathy نماذج

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

دراسة Ribonucleotide التأسيس: كشف حبلا على حدة Ribonucleotides في جينوم الخميرة وقياس الطفرات المستحثة Ribonucleotide

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

التصوير بالخلايا الحية لتقييم ديناميات توقيت الطور ومصير الخلية بعد اضطرابات المغزل الميتوتيك

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...