Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) til S.B. Data, der blev brugt i dette arbejde, blev (delvist) produceret gennem GenSeq-tekniske faciliteter ved Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier med støtte fra LabEx CeMEB, et ANR "Investissements d'avenir" -program (ANR-10-LABX-04-01).

Opsætning af denne protokol kræver præcis viden om indsættelses-, sletnings-, inversions- eller duplikeringspunktet inden for forfædresekvensen. Disse oplysninger opnås normalt ved helgenomsekventering (WGS) af slut- eller mellempunktprøverne. I den følgende protokol er det generelle princip for tilfælde af en insertionsmutation angivet for hvert trin sammen med et repræsentativt tilfælde, hvor hyppigheden af en IS10-indsættelse i mutS-genet i en eksperimentel evolutionspopulation af E. coli </em...

<ol>
	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846 (2014).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence.">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li><li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability.">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li><li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria.">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li><li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature.">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li><li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria.">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).</li><li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer.">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects.">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li><li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2,000+generations.">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50,000-generation+experiment.">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li><li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

Her har vi foreslået en omkostningseffektiv metode, der gør det muligt at følge dynamikken i nye adaptive SV-alleler i eksperimentelle evolutionspopulationer. Denne metode kombinerer klassiske PCR-teknikker og automatiseret parallel kapillærelektroforese, hvilket gør det muligt at bestemme de relative mængder af to alleler. Når den er oprettet, tillader den kvantificering af allelproportioner i mange prøver parallelt og er meget billigere end WGS. Denne metode kan ses som en ækvivalent til amplicon sekventering ...

Strukturelle varianter (SV'er) er ændringer af den genomiske sekvens, der generelt påvirker 50 bp eller mere. De fire kategorier af beskrevne SV'er er store indsættelser, store sletninger, inversioner og dubletter. Indtil for nylig har der været mere opmærksomhed på enkeltnukleotidvarianter (SNV'er) end på strukturelle varianter med hensyn til deres fænotypiske virkninger og deres rolle som genetiske determinanter for sygdom eller deres bidrag til tilpasning. Dette skyldes sandsynligvis, at det er lettere både at opdage SNV'er og forudsige deres fænotypiske virkninger. Imidlertid har kort- og langlæste dybe sekventeringsteknologier kraftigt forbedret påvisningen af SV'er, i det mindste i enkeltindivider eller klonale genomer1. Parallelt hermed er deres fænotypiske virkninger blevet bedre karakteriseret, og mange eksempler på deres implikation som genetiske determinanter for menneskelig sygdom 2,3 eller tilpasning til et nyt miljø4 er blevet dokumenteret.
Deletioner og indsættelser, ofte på grund af indsættelser af mobile genetiske elementer (MGE), er meget mere forstyrrende end enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er) og fører til frameshift-mutationer og proteinstrukturmodifikationer. Deletioner og MGE-indsættelser i gener resulterer næsten altid i geninaktivering, og indsættelser i ikke-kodende regioner kan føre til undertrykkelse eller konstitutiv ekspression af tilstødende gener, når insertionssekvenser (IS'er) indeholder promotor- eller termineringssekvenser5. Mens knockout af essentielle gener fører til klare skadelige virkninger på bakteriel fitness, er tabet af ikke-essentielle gener gavnligt i nogle tilfælde. På trods af deres iboende omkostninger kan duplikationer også være fordelagtige og deltage i tilpasning, da de fører til en ændring i gendosering; En stigning i aktiviteten af et specifikt protein kan være fordelagtigt afhængigt af betingelserne6.
Mikrobielle eksperimentelle evolutionspopulationer startes normalt med kloner. Dette oprindelige fravær af genetisk diversitet kombineret med reagensglassenes "lukkede miljø", der er karakteristisk for reagensglas, fører til et meget begrænset udviklingspotentiale ved gengevinst gennem horisontal genoverførsel og rekombination. Under disse særlige omstændigheder er bidraget til tilpasning af deletioner, duplikationer og intragenomisk MGE-indsættelse særlig vigtigt; bakterier tilpasser sig ofte gennem tab af funktionsmutationer (hovedsageligt på grund af deletioner eller MGE-indsættelser), der påvirker gener, der ikke er nyttige i stabile, ofte næringsrige, monokultur kunstige miljøer7. I det længst kørende E . coli-evolutionseksperiment er IS150-indsættelser særligt hyppige blandt populationer udviklet efter 50.000 generationer, hvor IS-elementer repræsenterer 35% af mutationerne, der når høj frekvens i populationer, der bevarer deres forfædres punktmutationshastighed8.
Udvikle og resequence undersøgelser par eksperimentel evolution og næste generations sekventering (NGS) teknologier for at undersøge, hvordan bakterier tilpasser sig på fænotypiske og genomiske niveauer til forskellige miljøforhold og belastninger, såsom forskellige kulstof- og energikilder, antibiotika og osmotisk stress 9,10,11 . Disse undersøgelser indhenter typisk genomisk information om de udviklede populationer eller kloner udelukkende ved det eksperimentelle endepunkt og i nogle tilfælde ved et antal mellemliggende tidspunkter12,13,14. Disse data giver indsigt i gener og veje, der er involveret i tilpasningen til et givet miljø, men giver sjældent forskere mulighed for at følge dynamikken i de novo nye og fejende alleler over tid.
En tilgang til at følge disse dynamikker er at vælge et begrænset antal segregerende alleler af interesse (på grund af funktionen af de gener, de påvirker, fordi de fejer parallelt i uafhængige populationer osv.) og bruge amplicon sekventering til at kvantificere allelandelen og samle mange tidspunkter i samme sekventeringskørsel15. Denne metode er med succes blevet brugt til at følge dynamikken i små størrelsesvarianter (SNP'er eller 1 bp indels) i eksperimentelle16 og naturlige17 populationer af mikrober. I tilfælde af større indel- eller MGE-indsættelser inducerer ampliconernes størrelsesforskel imidlertid PCR-effektivitetsforskelle, hvilket forvrænger forholdet mellem læse- og allelproportioner. I visse tilfælde er størrelsesforskellen mellem de to alleler bedre end ampliconens klassiske længde. Her koblede vi en triplet PCR-teknik med automatiseret parallel kapillærelektroforese for at kvantificere den relative frekvens af en indsættelsesallel baseret på størrelsesdiskrimination. Denne tilgang gør det muligt at udnytte underudnyttede eksperimentelle tidspunkter til at bestemme dynamikken i en ny mutant allel og følge dens hyppighed til fiksering eller tab på en omkostningseffektiv måde. Vi anvendte denne metode til at spore nye mutS-alleler, muteret gennem en IS10-indsættelse, hvilket gav den muterede genotype en hypermutatorfænotype.
Denne metode kræver to målalleler med en forskel på ≥5% i størrelse. For det første er primertrillinger designet til at producere fragmenter af samme størrelse, som deler en fælles primer. For det andet optimeres PCR-forholdene, og der fremstilles en kalibreringskurve ved hjælp af blandinger af vildtype (WT) og mutant gDNA. Endelig forstærkes prøver ved PCR, og den relative frekvens af hver allel kvantificeres ved parallel kvantitativ kapillærelektroforese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

Strukturelle varianter (SV'er) (dvs. deletioner, indsættelser, duplikationer og inversioner) er nu kendt for at spille en vigtig rolle i fænotypisk variation og følgelig i processer som sygdomsbestemmelse eller tilpasning til et nyt miljø. Imidlertid får enkeltnukleotidvarianter meget mere opmærksomhed end SV'er, sandsynligvis fordi de er lettere at opdage, og deres fænotypiske virkninger er lettere at forudsige. Udviklingen af kort- og langlæste dybsekventeringsteknologier har i høj grad forbedret detektionen af SV'er, men kvantificeringen af deres frekvens fra pooled sequencing (poolseq) data er stadig teknisk kompleks og dyr.
Her præsenterer vi en ret simpel og billig metode, som gør det muligt for forskere at følge dynamikken i SV-allelfrekvensen. Som et eksempel på anvendelse følger vi hyppigheden af en indsættelsessekvens (IS) indsættelse i eksperimentelle evolutionspopulationer af bakterier. Denne metode er baseret på design af tripletter af primere omkring de strukturelle variantgrænser, således at amplikonerne produceret ved forstærkning af vildtypen (WT) og afledte alleler varierer i størrelse med mindst 5%, og at deres forstærkningseffektivitet er ens. Mængden af hver amplicon bestemmes derefter ved parallel kapillærelektroforese og normaliseres til en kalibreringskurve. Denne metode kan let udvides til kvantificering af hyppigheden af andre strukturelle varianter (deletioner, duplikationer og inversioner) og til pool-seq-tilgange for naturlige populationer, herunder patogenpopulationer inden for patientindlæggelsen.

Ved hjælp af DNA ekstraheret fra en forfædres klon og en hypermutatorklon isoleret fra S2.11-populationen ved generation 1.000 etablerede vi kalibreringskurven vist i figur 2. De faktiske mutantproportioner fra laboratoriefremstillede DNA-blandinger og målt med det parallelle kapillærelektroforeseinstrument var forbundet med et lineært forhold med hældning 1,0706 med enR2 på 0,9705. Derudover var der en god overensstemmelse mellem biologiske replikater; Standardafvigelsen v...

Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Vi udviklede en omkostningseffektiv metode til at følge ikke-enkelt nukleotidpolymorfisme-alleldynamik, der let kan tilpasses eksperimentelle evolutionsfrosne arkiver. En triplet PCR-teknik blev kombineret med automatiseret parallel kapillærelektroforese for at kvantificere den relative frekvens af en indsættelsesallel i løbet af eksperimentel evolution.

Følg dynamikken i strukturelle varianter i eksperimentelt udviklede populationer

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Strukturelle varianter såsom indsættelser, deletioner, duplikationer og inversioner har tidligere været vanskeligere at følge eksperimentelt, og deres frekvenser kan ikke måles nøjagtigt ved hjælp af amplicon sekventering. Her leverer vi en enkel omkostningseffektiv teknik, der kobler tredobbelt primerdesign og parallel kapillærelektroferese for at følge strukturelle variantallelfrekvenser over tid. Denne metode blev designet til at supplere endepunktsekventering i eksperimentel evolution og til at spore frekvenserne af nye de novo-alleler.Vi håber, at denne metode også vil gavne dem, der arbejder med intra-værter patogendata. Jeanne Hamet, en forskningsassistent fra vores laboratorium, demonstrerer proceduren. De forskellige trin i metoderne vil blive vist i et tilfælde, hvor den afledte allel skyldes en IS10-indsættelse i et bakteriegen kaldet mutS.Design først et par primere for at forstærke en kort amplicon på vildtypeallelen omkring mutantindsættelsesstedet. Design en tredje primer fremadgående primer to inden for indsættelsessekvensen for at producere en lille størrelsesvariabel fra vildtypeamplicon. Begynd med at ekstrahere DNA fra 24-timers kulturer af faste vildtype- og mutante allelkloner.Efter kvantificering af DNA'et fortyndes hvert DNA-ekstrakt til fem nanogram pr. Mikroliter med vand. Fastgør de to prøver i et forhold på 50/50. Opsæt en 20-mikroliters reaktion indeholdende 10 nanogram DNA-prøve, primere og PCR-masterblanding.Derefter adskilles PCR-produktet ved elektroforese ved hjælp af en 2% agarosegel. Størrelsesforskellen mellem amplicons fra wild typen og mutanten skal verificeres på gelen. For at opnå en kalibreringskurve skal du begynde med at blande vildtype-DNA og mutant DNA i forskellige forhold.Fortynd PCR-produkterne til 0,1 nanogram pr. mikroliter koncentration. For at forberede separationsgelen blandes den friske gel og farvestoffet. Udskift indløbsbufferen.Placer skyllebufferen i den korrekte skuffeplacering af instrumentet til parallel kapillær elektroforese. Tilsæt 22 mikroliter fortyndingsmarkør til brøndene på en 96 brøndplade. Tilsæt nu to mikroliter af de fortyndede PCR-produkter til hver prøvebrønd.Til en Nå, tilføj en DNA-størrelsesstige fra et højfølsomhedssæt, der spænder fra et til 6.000 basepar i størrelse. Placer mikropladen i instrumentet med parallel kapillær elektroforese under udvalgte kørsel på instrumentsoftwaren. Analyser resultaterne ved hjælp af dataanalysesoftwaren.Først skal du identificere toppe baseret på deres kendte størrelse. Kvantificer hver amplicon for at producere en kalibreringskurve. Endelig kontrolleres det, at de relative mængder af de to alleler måles korrekt.Denne kalibreringskurve bruges derefter til at beregne mængden af strukturelle varianter efter PCR-amplifikation og parallel kapillærelektroforese. Disse repræsentative resultater følger en forstyrrende indsættelse i mutS-genet. Knockdowns og mutS fører til en hypermutatorfænotype, der gør det muligt for bakterier at prøve flere mutationer end deres basemutationshastighed.Ved hjælp af den præsenterede metode blev mutS-strukturvariantfrekvensen sporet over 1000 generationer. En ikke-monoton bane af den nye mutante allel blev afsløret. Den mutante allel blev først påvist ved generation 680.Allelen steg derefter hurtigt i frekvens og nåede 67%ved generation 713. Denne stigning stagnerede derefter og steg kun 10% i løbet af de næste 53 generationer til 76%Uventet faldt den mutante allelfrekvens derefter fra 76% til 49% i løbet af 13 generationer, hvorefter den steg til fiksering. Denne metode vil gavne dem, der arbejder med eksperimentel evolution.Denne protokol giver brugeren mulighed for at tage frosne arkiver og udforske evolutionære baner, der ellers ikke kan observeres med slutpunktsekventeringsdata.

Research

JoVE Journal

Biology

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studere Proteolyse af cyclin B på enkelt celle niveau i hele cellepopulationer

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv opsamling af 5-hydroxymethylcytosine fra genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isolerende potenseret Hsp104 Varianter med Gær Proteinopathy Modeller

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studere Ribonucleotide vedtægter: Strand-specifik påvisning af Ribonucleotides i gær genom og måling Ribonucleotide-induceret mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live Cell Imaging til at vurdere dynamikken i metafase timing og celle skæbne efter mitotiske spindel forstyrrelser

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...