Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) aan S.B. De gegevens die in dit werk werden gebruikt, werden (gedeeltelijk) geproduceerd door de technische faciliteiten van GenSeq van het Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier met de steun van LabEx CeMEB, een ANR "Investissements d'avenir" -programma (ANR-10-LABX-04-01).

Het instellen van dit protocol vereist nauwkeurige kennis van het invoeg-, deletie-, inversie- of duplicatiepunt binnen de voorouderlijke reeks. Deze informatie wordt meestal verkregen door whole-genome sequencing (WGS) van de eind- of tussenpuntmonsters. In het volgende protocol wordt het algemene principe voor het geval van een insertiemutatie gegeven voor elke stap, naast een representatief geval waarin de frequentie van een IS10-insertie in het mutS-gen in een experimentele evolutiepopulatie van E. coli ...

<ol>
	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846 (2014).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence.">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li><li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability.">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li><li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria.">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li><li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature.">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li><li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria.">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).</li><li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer.">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects.">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li><li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2,000+generations.">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50,000-generation+experiment.">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li><li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

Hier hebben we een kosteneffectieve methode voorgesteld waarmee de dynamiek van opkomende adaptieve SV-allelen in experimentele evolutiepopulaties kan worden gevolgd. Deze methode koppelt klassieke PCR-technieken en geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese, waardoor de relatieve hoeveelheden van twee allelen kunnen worden bepaald. Eenmaal ingesteld, maakt het de kwantificering van allelverhoudingen in veel monsters parallel mogelijk en is het veel goedkoper dan WGS. Deze methode kan worden gezien als een equi...

Structurele varianten (SV's) zijn veranderingen van de genomische sequentie, die over het algemeen 50 bp of meer beïnvloeden. De vier categorieën beschreven SV's zijn grote inserties, grote deleties, inversies en duplicaties. Tot voor kort werd meer aandacht besteed aan single-nucleotidevarianten (SNV's) dan aan structurele varianten, in termen van hun fenotypische effecten en hun rol als genetische determinanten van ziekte, of hun bijdrage aan aanpassing. Dit komt waarschijnlijk omdat het gemakkelijker is om zowel SNV's te detecteren als hun fenotypische effecten te voorspellen. Kort- en langleestechnologieën voor diepe sequencing hebben de detectie van SV's echter sterk verbeterd, althans in individuele of klonale genomen1. Tegelijkertijd zijn hun fenotypische effecten beter gekarakteriseerd en zijn er veel voorbeelden van hun implicatie als genetische determinanten van menselijke ziekte 2,3 of aanpassing aan een nieuwe omgeving4 gedocumenteerd.
Deleties en inserties, vaak als gevolg van mobiele genetische element (MGE) inserties, zijn veel disruptiever dan single nucleotide polymorphisms (SNP's) en leiden tot frameshift mutaties en eiwitstructuurmodificaties. Deleties en MGE-inserties in genen resulteren bijna altijd in geninactivatie, en inserties in niet-coderende regio's kunnen leiden tot repressie of constitutieve expressie van aangrenzende genen wanneer insertiesequenties (IS's) promotor- of beëindigingssequenties bevatten5. Hoewel het uitschakelen van essentiële genen leidt tot duidelijke schadelijke effecten op bacteriële fitheid, is het verlies van niet-essentiële genen in sommige gevallen gunstig. Ondanks hun inherente kosten kunnen duplicaties ook voordelig zijn en deelnemen aan aanpassing omdat ze leiden tot een verandering in de gendosering; Een toename van de activiteit van een specifiek eiwit kan voordelig zijn, afhankelijk van de omstandigheden6.
Microbiële experimentele evolutiepopulaties worden meestal gestart met klonen. Deze aanvankelijke afwezigheid van genetische diversiteit, gecombineerd met de "gesloten omgeving" die kenmerkend is voor reageerbuizen, leidt tot een zeer beperkt potentieel van evolutie door genwinst door horizontale genoverdracht en recombinatie. In deze specifieke omstandigheden is de bijdrage aan de aanpassing van deleties, duplicaties en intragenomische MGE-insertie bijzonder belangrijk; bacteriën passen zich vaak aan door mutaties in functieverlies (voornamelijk als gevolg van deleties of MGE-inserties), waardoor genen worden aangetast die niet nuttig zijn in stabiele, vaak voedselrijke, monocultuur kunstmatige omgevingen7. In het langstlopende E. coli-evolutie-experiment komen IS150-inserties vooral vaak voor bij populaties die na 50.000 generaties zijn geëvolueerd, waarbij IS-elementen 35% van de mutaties vertegenwoordigen die een hoge frequentie bereiken in populaties die hun voorouderlijke puntmutatiesnelheidbehouden 8.
Evolueren en resequence studies koppelen experimentele evolutie en next-generation sequencing (NGS) technologieën om te onderzoeken hoe bacteriën zich aanpassen, op fenotypisch en genomisch niveau, aan verschillende omgevingsomstandigheden en stress, zoals verschillende koolstof- en energiebronnen, antibiotica en osmotische stress 9,10,11 . Deze studies verkrijgen meestal genomische informatie over de geëvolueerde populaties of klonen alleen op het experimentele eindpunt, en in sommige gevallen op een aantal tussenliggende tijdstippen12,13,14. Deze gegevens geven inzicht in genen en paden die betrokken zijn bij de aanpassing aan een bepaalde omgeving, maar stellen onderzoekers zelden in staat om de dynamiek van de novo opkomende en vegende allelen in de loop van de tijd te volgen.
Een benadering om deze dynamiek te volgen is om een beperkt aantal scheidende allelen van belang te kiezen (vanwege de functie van de genen die ze beïnvloeden, omdat ze parallel lopen in onafhankelijke populaties, enz.) en ampliconsequencing te gebruiken om de allelverhouding te kwantificeren, waarbij veel tijdspunten in dezelfde sequencingrun15 worden samengevoegd. Deze methode is met succes gebruikt om de dynamiek van kleine varianten (SNP's of 1 bp indels) te volgen in experimentele16 en natuurlijke17 populaties van microben. In het geval van grotere indels of MGE-inserties veroorzaakt het grootteverschil van de amplicons echter PCR-efficiëntieverschillen, die de relatie tussen lees- en allelverhoudingen verstoren. In bepaalde gevallen is het grootteverschil tussen de twee allelen superieur aan de klassieke lengte van het amplicon. Hier hebben we een triplet PCR-techniek gekoppeld aan geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese om de relatieve frequentie van een insertie-allel te kwantificeren op basis van groottediscriminatie. Deze benadering maakt het mogelijk om onderbenutte experimentele tijdspunten te benutten om de dynamiek van een opkomend mutant allel te bepalen en de frequentie ervan te volgen tot fixatie of verlies, op een kosteneffectieve manier. We pasten deze methode toe om opkomende mutS-allelen te volgen, gemuteerd door een IS10-insertie, waardoor het gemuteerde genotype een hypermutatorfenotype kreeg.
Deze methode vereist twee doelallelen met een verschil van ≥5% in grootte. Ten eerste zijn primer-drielingen ontworpen om fragmenten van vergelijkbare grootte te produceren, die een gemeenschappelijke primer delen. Ten tweede worden pcr-condities geoptimaliseerd en wordt een kalibratiecurve geproduceerd met behulp van mixen van wild-type (WT) en mutant gDNA. Ten slotte worden monsters versterkt door PCR en wordt de relatieve frequentie van elk allel gekwantificeerd door parallelle kwantitatieve capillaire elektroforese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

Van structurele varianten (SV's) (d.w.z. deleties, inserties, duplicaties en inversies) is nu bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij fenotypische variatie, en bijgevolg bij processen zoals ziektebepaling of aanpassing aan een nieuwe omgeving. Single-nucleotidevarianten krijgen echter veel meer aandacht dan SV's, waarschijnlijk omdat ze gemakkelijker te detecteren zijn en hun fenotypische effecten gemakkelijker te voorspellen zijn. De ontwikkeling van short- en long-read deep sequencing-technologieën heeft de detectie van SV's sterk verbeterd, maar de kwantificering van hun frequentie uit poolseq-gegevens (poolseq) is technisch nog steeds complex en duur.
Hier presenteren we een vrij eenvoudige en goedkope methode, waarmee onderzoekers de dynamiek van SV-allelfrequentie kunnen volgen. Als voorbeeld van toepassing volgen we de frequentie van een insertiesequentie (IS) insertie in experimentele evolutiepopulaties van bacteriën. Deze methode is gebaseerd op het ontwerp van drietallen van primers rond de structurele variantranden, zodanig dat de ampliconen geproduceerd door amplificatie van het wild-type (WT) en afgeleide allelen ten minste 5% in grootte verschillen en dat hun versterkingsefficiëntie vergelijkbaar is. De hoeveelheid van elk amplicon wordt vervolgens bepaald door parallelle capillaire elektroforese en genormaliseerd tot een kalibratiecurve. Deze methode kan eenvoudig worden uitgebreid tot de kwantificering van de frequentie van andere structurele varianten (deleties, duplicaties en inversies) en tot pool-seq-benaderingen van natuurlijke populaties, inclusief pathogene populaties binnen de patiënt.

Met behulp van DNA geëxtraheerd uit een voorouderlijke kloon en een hypermutatorkloon geïsoleerd uit de S2.11-populatie bij generatie 1.000, hebben we de kalibratiecurve vastgesteld die in figuur 2 wordt weergegeven. De werkelijke mutante verhoudingen van in het laboratorium bereide DNA-mengsels en gemeten door het parallelle capillaire elektroforese-instrument waren verbonden door een lineaire relatie van helling 1,0706, met een R2 van 0,9705. Daarnaast was er een goede overeen...

Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

We ontwikkelden een kosteneffectieve methode om niet-enkelvoudige nucleotide polymorfisme alleldynamica te volgen die gemakkelijk kan worden aangepast aan experimentele evolutie bevroren archieven. Een triplet PCR-techniek werd gekoppeld aan geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese om de relatieve frequentie van een insertie-allel in de loop van de experimentele evolutie te kwantificeren.

Het volgen van de dynamiek van structurele varianten in experimenteel geëvolueerde populaties

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Structurele varianten zoals inserties, deleties, duplicaties en inversies zijn in het verleden moeilijker experimenteel te volgen geweest en hun frequenties kunnen niet nauwkeurig worden gemeten door ampliconsequencing. Hier bieden we een eenvoudige kosteneffectieve techniek, die drievoudig primerontwerp en parallelle capillaire elektroferese koppelt om structurele variant allelfrequenties in de loop van de tijd te volgen. Deze methode is ontworpen om endpoint sequencing in experimentele evolutie aan te vullen en om de frequenties van opkomende de novo allelen te traceren.We hopen dat deze methode ook ten goede zal komen aan degenen die werken met pathogene gegevens over intra-hosts. De procedure wordt gedemonstreerd door Jeanne Hamet, een onderzoeksassistente van ons laboratorium. De verschillende stappen van de methoden zullen worden getoond in een geval waarin het afgeleide allel het resultaat is van een IS10-insertie in een bacterieel gen genaamd mutS.Ontwerp eerst een paar primers om een kort amplicon op het wildtype allel rond de mutante insertieplaats te versterken. Ontwerp een derde primer voorwaartse primer twee binnen de invoegvolgorde om een lichte groottevariabele van het wildtype amplicon te produceren. Begin met het extraheren van DNA uit 24-uursculturen van vaste wilde en gemuteerde allelklonen.Na het kwantificeren van het DNA, verdun elk DNA-extract tot vijf nanogram per microliter met water. Bevestig de twee monsters in een verhouding van 50/50. Stel een reactie van 20 microliter in met 10 nanogram DNA-monster, primers en PCR-mastermix.Scheid vervolgens het PCR-product door elektroforese, met behulp van een 2% agarose-gel. Het grootteverschil tussen de amplicons van het wilde type en de mutant moet op de gel worden geverifieerd. Om een kalibratiecurve te verkrijgen, begint u met het mengen van het wildtype DNA en het mutante DNA in verschillende verhoudingen.Verdun de PCR-producten tot 0,1 nanogram per microliterconcentratie. Om de scheidingsgel te bereiden, mengt u de verse gel en kleurstof. Vervang de inlaatbuffer.Plaats de spoelbuffer op de juiste ladeplaats van het parallelle capillaire elektroforese-instrument. Voeg 22 microliter van de verdunningsmarker toe aan de putjes van een 96-putplaat. Voeg nu twee microliter van de verdunde PCR-producten toe aan elk monsterput.Voeg aan één Well een DNA-grootteladder toe uit een hooggevoeligheidskit, variërend van één tot 6.000 basenparen in grootte. Plaats de microplaat in het parallelle capillaire elektroforese-instrument in geselecteerde run op de instrumentsoftware. Analyseer de resultaten met behulp van de data-analysesoftware.Identificeer eerst de pieken op basis van hun bekende grootte. Kwantificeer elk amplicon om een kalibratiecurve te produceren. Controleer ten slotte of de relatieve hoeveelheden van de twee allelen correct zijn gemeten.Deze kalibratiecurve wordt vervolgens gebruikt om de hoeveelheid structurele varianten te berekenen na PCR-versterking en parallelle capillaire elektroforese. Deze representatieve resultaten volgen op een verstorende insertie in het mutS-gen. Knockdowns en mutS leiden tot een hypermutatorfenotype, waardoor bacteriën meer mutaties kunnen bemonsteren dan hun basismutatiesnelheid.Met behulp van de gepresenteerde methode werd de frequentie van de mutS-structurele variant gevolgd over 1000 generaties. Een niet-monotoon traject van het opkomende mutante allel werd onthuld. Het gemuteerde allel werd voor het eerst gedetecteerd bij generatie 680.Het allel nam vervolgens snel in frequentie toe en bereikte 67% bij generatie 713. Deze toename stagneerde vervolgens en nam slechts 10% toe in de volgende 53 generaties, tot 76% Onverwacht daalde de mutante allelfrequentie vervolgens van 76% tot 49% in de loop van 13 generaties, waarna het toenam tot fixatie. Deze methode zal ten goede komen aan degenen die werken aan experimentele evolutie.Dit protocol stelt de gebruiker in staat om bevroren archieven te nemen en evolutionaire trajecten te verkennen die anders niet waarneembaar zijn met endpoint sequencing-gegevens.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotobleken Analyses (FRAP &amp; FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

De Slice kweekmethode voor Na Ontwikkeling van Tooth Germs In explantaatkweek

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...