Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
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Ce travail a été soutenu par l’ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) à S.B. Les données utilisées dans ces travaux ont été (en partie) produites par les installations techniques GenSeq de l’Institut des Sciences de l’Evolution de Montpellier avec le soutien du LabEx CeMEB, programme ANR « Investissements d’avenir » (ANR-10-LABX-04-01).

La mise en place de ce protocole nécessite une connaissance précise du point d’insertion, de suppression, d’inversion ou de duplication au sein de la séquence ancestrale. Cette information est généralement obtenue par séquençage du génome entier (WGS) des échantillons terminaux ou intermédiaires. Dans le protocole suivant, le principe général pour le cas d’une mutation d’insertion est donné pour chaque étape, à côté d’un cas représentatif où la fréquence d’une insertion IS10 dans le gène ...

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	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

Ici, nous avons proposé une méthode rentable qui permet de suivre la dynamique des allèles SV adaptatifs émergents dans les populations expérimentales de l’évolution. Cette méthode associe des techniques classiques de PCR et une électrophorèse capillaire parallèle automatisée, ce qui permet de déterminer les quantités relatives de deux allèles. Une fois mis en place, il permet de quantifier les proportions d’allèles dans de nombreux échantillons en parallèle, et est beaucoup moins coûteux que WGS. C...

Les variantes structurelles (SV) sont des altérations de la séquence génomique, affectant généralement 50 pb ou plus. Les quatre catégories de SV décrites sont les grandes insertions, les suppressions importantes, les inversions et les duplications. Jusqu’à récemment, on accordait plus d’attention aux variantes mononucléotidiques (SNV) qu’aux variantes structurelles, en termes d’effets phénotypiques et de leur rôle en tant que déterminants génétiques de la maladie, ou de leur contribution à l’adaptation. C’est probablement parce qu’il est plus facile de détecter les SNV et de prédire leurs effets phénotypiques. Cependant, les technologies de séquençage profond à lecture courte et longue ont fortement amélioré la détection des SV, au moins dans les génomes individuels ou clonaux1. En parallèle, leurs effets phénotypiques ont été mieux caractérisés, et de nombreux exemples de leur implication en tant que déterminants génétiques de la maladie humaine 2,3 ou de l’adaptation à un nouvel environnement4 ont été documentés.
Les délétions et les insertions, souvent dues à des insertions d’éléments génétiques mobiles (MGE), sont beaucoup plus perturbatrices que les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) et entraînent des mutations par décalage de trame et des modifications de la structure des protéines. Les délétions et les insertions de MGE dans les gènes entraînent presque toujours l’inactivation des gènes, et les insertions dans des régions non codantes peuvent entraîner une répression ou une expression constitutive de gènes adjacents lorsque les séquences d’insertion (SI) contiennent des séquences promotrices ou de terminaison5. Alors que l’élimination des gènes essentiels entraîne des effets néfastes évidents sur la condition physique bactérienne, la perte de gènes non essentiels est bénéfique dans certains cas. Malgré leurs coûts inhérents, les duplications peuvent également être avantageuses et participer à l’adaptation car elles entraînent un changement de dosage des gènes; Une augmentation de l’activité d’une protéine spécifique peut être avantageuse selon les conditions6.
Les populations d’évolution expérimentale microbienne sont généralement commencées avec des clones. Cette absence initiale de diversité génétique, combinée à la caractéristique « environnement fermé » des éprouvettes, conduit à un potentiel très limité d’évolution par gain de gènes par transfert horizontal de gènes et recombinaison de gènes. Dans ces conditions spécifiques, la contribution à l’adaptation des délétions, des duplications et de l’insertion intragénomique de MGE est particulièrement importante; Les bactéries s’adaptent souvent par des mutations de perte de fonction (principalement dues à des délétions ou à des insertions de MGE), affectant des gènes qui ne sont pas utiles dans des environnements artificiels de monoculture stables, souvent riches en nutriments7. Dans l’expérience d’évolution d’E. coli la plus longue, les insertions d’IS150 sont particulièrement fréquentes parmi les populations ayant évolué après 50 000 générations, les éléments IS représentant 35% des mutations qui atteignent une fréquence élevée dans les populations qui conservent leur taux de mutation ponctuelle ancestral8.
Les études d’évolution et de reséquence associent les technologies d’évolution expérimentale et de séquençage de nouvelle génération (NGS) pour étudier comment les bactéries s’adaptent, aux niveaux phénotypique et génomique, à différentes conditions et contraintes environnementales, telles que différentes sources de carbone et d’énergie, les antibiotiques et le stress osmotique 9,10,11 . Ces études obtiennent généralement des informations génomiques sur les populations évoluées ou les clones uniquement au point final expérimental et, dans certains cas, à un certain nombre de points temporels intermédiaires12,13,14. Ces données donnent un aperçu des gènes et des voies impliqués dans l’adaptation à un environnement donné, mais permettent rarement aux chercheurs de suivre la dynamique des allèles émergents et balayants de novo au fil du temps.
Une approche pour suivre ces dynamiques consiste à choisir un nombre limité d’allèles ségrégateurs d’intérêt (en raison de la fonction des gènes qu’ils affectent, parce qu’ils balayent en parallèle dans des populations indépendantes, etc.) et à utiliser le séquençage d’amplicon pour quantifier la proportion d’allèles, en regroupant de nombreux points temporels dans le même séquençage15. Cette méthode a été utilisée avec succès pour suivre la dynamique de variantes de petite taille (SNP ou indels de 1 pb) dans des populations expérimentalesde microbes 16 etnaturelles 17 . Cependant, dans le cas d’insertions plus grandes ou d’insertions MGE, la différence de taille des amplicons induit des différences d’efficacité de PCR, ce qui fausse la relation entre les proportions de lecture et d’allèle. Dans certains cas, la différence de taille entre les deux allèles est supérieure à la longueur classique de l’amplicon. Ici, nous avons couplé une technique de PCR triplet avec une électrophorèse capillaire parallèle automatisée pour quantifier la fréquence relative d’un allèle d’insertion basé sur la discrimination de taille. Cette approche permet d’exploiter des points temporels expérimentaux sous-utilisés pour déterminer la dynamique d’un allèle mutant émergent et suivre sa fréquence de fixation ou de perte, de manière rentable. Nous avons appliqué cette méthode pour suivre les allèles mutS- émergents, mutés par insertion IS10, fournissant au génotype muté un phénotype hypermutateur.
Cette méthode nécessite deux allèles cibles avec une différence de taille de ≥5%. Tout d’abord, les triplets d’amorce sont conçus pour produire des fragments de taille similaire, qui partagent une amorce commune. Deuxièmement, les conditions de PCR sont optimisées et une courbe d’étalonnage est produite à l’aide de mélanges d’ADNg de type sauvage (WT) et mutant. Enfin, les échantillons sont amplifiés par PCR, et la fréquence relative de chaque allèle est quantifiée par électrophorèse capillaire quantitative parallèle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

On sait maintenant que les variantes structurelles (SV) (c.-à-d. les délétions, les insertions, les duplications et les inversions) jouent un rôle important dans la variation phénotypique et, par conséquent, dans des processus tels que la détermination de la maladie ou l’adaptation à un nouvel environnement. Cependant, les variantes mononucléotidiques reçoivent beaucoup plus d’attention que les SV, probablement parce qu’elles sont plus faciles à détecter et que leurs effets phénotypiques sont plus faciles à prévoir. Le développement de technologies de séquençage profond à lecture courte et longue a fortement amélioré la détection des SV, mais la quantification de leur fréquence à partir des données de séquençage groupé (poolseq) est encore techniquement complexe et coûteuse.
Ici, nous présentons une méthode plutôt simple et peu coûteuse, qui permet aux chercheurs de suivre la dynamique de la fréquence des allèles SV. À titre d’exemple d’application, nous suivons la fréquence d’insertion d’une séquence d’insertion (SI) dans des populations expérimentales d’évolution bactérienne. Cette méthode est basée sur la conception de triplets d’amorces autour des bordures de variantes structurelles, de sorte que les amplicons produits par amplification des allèles de type sauvage (WT) et dérivés diffèrent en taille d’au moins 5%, et que leur efficacité d’amplification est similaire. La quantité de chaque amplicon est ensuite déterminée par électrophorèse capillaire parallèle et normalisée à une courbe d’étalonnage. Cette méthode peut être facilement étendue à la quantification de la fréquence d’autres variantes structurelles (délétions, duplications et inversions) et aux approches pool-seq des populations naturelles, y compris les populations pathogènes intra-hospitalisées.

En utilisant l’ADN extrait d’un clone ancestral et d’un clone hypermutateur isolé de la population S2.11 à la génération 1 000, nous avons établi la courbe d’étalonnage illustrée à la figure 2. Les proportions mutantes réelles provenant de mélanges d’ADN préparés en laboratoire et mesurées par l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle ont été liées par une relation linéaire de pente 1,0706, avec un R2 de 0,9705. De plus, il y avait une bo...

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Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Nous avons développé une méthode rentable pour suivre la dynamique des allèles de polymorphisme non nucléotidique qui peut facilement être adaptée aux archives congelées de l’évolution expérimentale. Une technique de PCR triplet a été couplée à une électrophorèse capillaire parallèle automatisée pour quantifier la fréquence relative d’un allèle d’insertion au cours de l’évolution expérimentale.

Suivi de la dynamique des variantes structurelles dans les populations expérimentalement évoluées

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Les variantes structurelles telles que les insertions, les suppressions, les duplications et les inversions ont été dans le passé plus difficiles à suivre expérimentalement, et leurs fréquences ne peuvent pas être mesurées avec précision par séquençage d’amplicon. Ici, nous fournissons une technique simple et rentable, qui associe la conception d’amorce triple et l’électrophérèse capillaire parallèle pour suivre les fréquences des allèles des variantes structurelles au fil du temps. Cette méthode a été conçue pour compléter le séquençage des paramètres dans l’évolution expérimentale et pour retracer les fréquences des allèles émergents de novo.Nous espérons que cette méthode profitera également à ceux qui travaillent avec des données sur les agents pathogènes intra-hôtes. La démonstration de la procédure sera assurée par Jeanne Hamet, une assistante de recherche de notre laboratoire. Les différentes étapes des méthodes seront montrées dans un cas où l’allèle dérivé résulte d’une insertion d’IS10 dans un gène bactérien appelé mutS.Commencez par concevoir une paire d’amorces pour amplifier un amplicon court sur l’allèle de type sauvage autour du site d’insertion mutant. Concevez une troisième amorce avant deux dans la séquence d’insertion pour produire une légère variable de taille à partir de l’amplicon de type sauvage. Commencez par extraire l’ADN de cultures de 24 heures de clones d’allèles sauvages et mutants fixes.Après avoir quantifié l’ADN, diluez chaque extrait d’ADN à cinq nanogrammes par microlitre avec de l’eau. Fixez les deux échantillons dans un rapport 50/50. Mettez en place une réaction de 20 microlitres contenant 10 nanogrammes d’échantillon d’ADN, d’amorces et de mélange principal PCR.Ensuite, séparez le produit PCR par électrophorèse, à l’aide d’un gel d’agarose à 2%. La différence de taille entre les amplicons du type sauvage et le mutant doit être vérifiée sur le gel. Pour obtenir une courbe d’étalonnage, commencez par mélanger l’ADN de type sauvage et l’ADN mutant dans différents ratios.Diluer les produits PCR à 0,1 nanogramme par concentration de microlitre. Pour préparer le gel de séparation, mélanger le gel frais et le colorant. Remplacez le tampon d’entrée (inlet buffer).Placez le tampon de rinçage à l’emplacement correct du tiroir de l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle. Ajouter 22 microlitres du marqueur de diluant aux puits d’une plaque de 96 puits. Ajoutez maintenant deux microlitres de produits PCR dilués à chaque puits d’échantillon.À un puits, ajoutez une échelle de taille d’ADN à partir d’un kit haute sensibilité, allant de une à 6 000 paires de bases. Placez la microplaque dans l’instrument d’électrophorèse capillaire parallèle en exécution sélective sur le logiciel de l’instrument. Analysez les résultats à l’aide du logiciel d’analyse de données.Tout d’abord, identifiez les pics en fonction de leur taille connue. Quantifier chaque amplicon pour produire une courbe d’étalonnage. Enfin, vérifiez que les quantités relatives des deux allèles sont correctement mesurées.Cette courbe d’étalonnage est ensuite utilisée pour calculer la quantité de variantes structurelles après amplification PCR et électrophorèse capillaire parallèle. Ces résultats représentatifs font suite à une insertion perturbatrice dans le gène mutS. Les knockdowns et mutS conduisent à un phénotype hyper mutateur, permettant aux bactéries d’échantillonner plus de mutations que leur taux de mutation de base.En utilisant la méthode présentée, la fréquence de la variante structurelle mutS a été suivie sur 1000 générations. Une trajectoire non monotone de l’allèle mutant émergent a été révélée. L’allèle mutant a été détecté pour la première fois à la génération 680.L’allèle a ensuite rapidement augmenté en fréquence, atteignant 67% à la génération 713. Cette augmentation a ensuite stagné, n’augmentant que de 10% au cours des 53 générations suivantes, à 76%De manière inattendue, la fréquence des allèles mutants a ensuite diminué de 76% à 49% au cours de 13 générations, après quoi elle a augmenté jusqu’à la fixation. Cette méthode profitera à ceux qui travaillent sur l’évolution expérimentale.Ce protocole permet à l’utilisateur de prendre des archives figées et d’explorer des trajectoires évolutives qui ne sont autrement pas observables avec des données de séquençage des points finaux.

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