Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) ל- S.B. הנתונים ששימשו בעבודה זו הופקו (בחלקם) באמצעות המתקנים הטכניים של GenSeq של המכון למדעים של מונפלייה בתמיכת LabEx CeMEB, תוכנית "Investissements d'avenir" של ANR (ANR-10-LABX-04-01).

הגדרת פרוטוקול זה דורשת ידע מדויק של נקודת ההכנסה, המחיקה, ההיפוך או השכפול בתוך רצף האבות. מידע זה מתקבל בדרך כלל על ידי ריצוף גנום שלם (WGS) של דגימות נקודת הקצה או הביניים. בפרוטוקול הבא ניתן העיקרון הכללי למקרה של מוטציית החדרה לכל שלב, לצד מקרה מייצג שבו עוקבים אחר תדירות החדרת IS10 לגן mutS...

<ol>
	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846 (2014).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence.">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li><li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability.">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li><li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria.">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li><li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature.">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li><li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria.">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).</li><li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer.">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects.">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li><li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2,000+generations.">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50,000-generation+experiment.">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li><li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

כאן, הצענו שיטה חסכונית המאפשרת לעקוב אחר הדינמיקה של אללי SV אדפטיביים מתפתחים באוכלוסיות אבולוציה ניסיונית. שיטה זו משלבת טכניקות PCR קלאסיות ואלקטרופורזה קפילרית מקבילית אוטומטית, המאפשרת לקבוע את הכמויות היחסיות של שני אללים. לאחר ההגדרה, היא מאפשרת לכמת את פרופורציות האלל בדגימות רבו?...

וריאנטים מבניים (SVs) הם שינויים ברצף הגנומי, המשפיעים בדרך כלל על 50 bp או יותר. ארבע הקטגוריות של SVs המתוארים הן הוספות גדולות, מחיקות גדולות, היפוכים וכפילויות. עד לאחרונה, תשומת לב רבה יותר הוקדשה לווריאנטים חד-נוקלאוטידים (SNVs) מאשר לווריאנטים מבניים, במונחים של ההשפעות הפנוטיפיות שלהם ותפקידם כגורמים גנטיים של מחלות, או תרומתם להסתגלות. זה כנראה בגלל שקל יותר גם לזהות SNV וגם לחזות את ההשפעות הפנוטיפיות שלהם. עם זאת, טכנולוגיות ריצוף עמוק לקריאה קצרה וארוכה שיפרו מאוד את הזיהוי של SVs, לפחות בגנום בודד או שבטי1. במקביל, ההשפעות הפנוטיפיות שלהם אופיינו טוב יותר, ותועדו דוגמאות רבות להשלכותיהם כגורמים גנטיים של מחלות אנושיות 2,3 או הסתגלות לסביבה חדשה4.
מחיקות והחדרות, לעתים קרובות עקב החדרת אלמנטים גנטיים ניידים (MGE), משבשות הרבה יותר מפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) ומובילות למוטציות בהסטת מסגרת ולשינויים במבנה החלבון. מחיקות והחדרות MGE בתוך גנים כמעט תמיד גורמות להשבתה של גנים, והחדרות לאזורים שאינם מקודדים יכולות להוביל לדיכוי או לביטוי מכונן של גנים סמוכים כאשר רצפי החדרה (ISs) מכילים רצפי מקדם או סיום5. בעוד שפגיעה בגנים חיוניים מובילה להשפעות מזיקות ברורות על כושר החיידקים, אובדן גנים לא חיוניים מועיל במקרים מסוימים. למרות העלויות הטבועות בהן, כפילויות יכולות גם להיות יתרון, ולהשתתף בהסתגלות מכיוון שהן מובילות לשינוי במינון הגנים; עלייה בפעילות של חלבון מסוים יכולה להיות יתרון בהתאם לתנאים6.
אוכלוסיות אבולוציה ניסיוניות מיקרוביאליות מתחילות בדרך כלל עם שיבוטים. היעדר ראשוני זה של מגוון גנטי, בשילוב עם "הסביבה הסגורה" המאפיינת מבחנות, מוביל לפוטנציאל מוגבל מאוד של אבולוציה על ידי רווח גנים באמצעות העברה אופקית של גנים ורקומבינציה. בתנאים ספציפיים אלה, התרומה להסתגלות של מחיקות, כפילויות והחדרת MGE תוך גנומית חשובה במיוחד; חיידקים מסתגלים לעתים קרובות באמצעות מוטציות של אובדן תפקוד (בעיקר עקב מחיקות או החדרות MGE), המשפיעות על גנים שאינם שימושיים בסביבות מלאכותיות יציבות, לעתים קרובות עשירות בחומרים מזינים,מונוקולטורה 7. בניסוי האבולוציה הארוך ביותר של E. coli , החדרות IS150 שכיחות במיוחד בקרב אוכלוסיות שהתפתחו לאחר 50,000 דורות, כאשר רכיבי IS מייצגים 35% מהמוטציות המגיעות לתדירות גבוהה באוכלוסיות השומרות על שיעור המוטציות של נקודת אבותיהם8.
מחקרי פיתוח וריצוף מחדש משלבים אבולוציה ניסיונית וטכנולוגיות ריצוף מהדור הבא (NGS) כדי לחקור כיצד חיידקים מסתגלים ברמה הפנוטיפית והגנומית לתנאים סביבתיים שונים וללחצים שונים, כגון מקורות פחמן ואנרגיה שונים, אנטיביוטיקה ועקה אוסמוטית 9,10,11 . מחקרים אלה בדרך כלל משיגים מידע גנומי על אוכלוסיות מפותחות או שיבוטים אך ורק בנקודת הסיום של הניסוי, ובמקרים מסוימים, במספר נקודות זמן ביניים12,13,14. נתונים אלה מספקים תובנה לגבי גנים ומסלולים המעורבים בהסתגלות לסביבה נתונה, אך רק לעתים רחוקות מאפשרים לחוקרים לעקוב אחר הדינמיקה של אללים מתפתחים וסוחפים דה נובו לאורך זמן.
גישה אחת לעקוב אחר דינמיקות אלה היא לבחור מספר מוגבל של אללים מפרידים בעלי עניין (בגלל תפקוד הגנים שהם משפיעים עליהם, מכיוון שהם סוחפים במקביל באוכלוסיות עצמאיות וכו ') ולהשתמש בריצוף אמפליקון כדי לכמת את יחס האלל, איגום נקודות זמן רבות באותו ריצוף15. שיטה זו שימשה בהצלחה כדי לעקוב אחר הדינמיקה של וריאנטים בגודל קטן (SNPs או 1 bp indels) בניסויים16 ו -17 אוכלוסיות טבעיות של חיידקים. עם זאת, במקרה של אינדל גדול יותר או החדרות MGE, הפרש הגודל של האמפליקונים גורם להבדלי יעילות PCR, אשר מעוותים את הקשר בין פרופורציות קריאה ואלל. במקרים מסוימים, הפרש הגודל בין שני האללים עדיף על האורך הקלאסי של האמפליקון. כאן, שילבנו טכניקת PCR משולשת עם אלקטרופורזה אוטומטית מקבילית של נימים כדי לכמת את התדירות היחסית של אלל החדרה בהתבסס על הבחנה בגודל. גישה זו מאפשרת ניצול של נקודות זמן ניסיוניות שאינן מנוצלות מספיק כדי לקבוע את הדינמיקה של אלל מוטנטי מתפתח ולעקוב אחר התדירות שלו לקיבוע או אובדן, באופן חסכוני. יישמנו שיטה זו כדי לעקוב אחר אללים מוטטיביים מתפתחים, שעברו מוטציה באמצעות החדרת IS10, וסיפקנו לגנוטיפ שעבר מוטציה פנוטיפ היפרמוטטור.
שיטה זו דורשת שני אללי מטרה עם הבדל של ≥5% בגודל. ראשית, שלישיות פריימר מתוכננות לייצר מקטעים בגודל דומה, החולקים פריימר משותף. שנית, תנאי PCR ממוטבים, ועקומת כיול נוצרת באמצעות תערובות של wild-type (WT) ו-gDNA מוטנטי. לבסוף, הדגימות מוגברות על ידי PCR, והתדירות היחסית של כל אלל מכומתת על ידי אלקטרופורזה קפילרית כמותית מקבילה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

וריאנטים מבניים (SVs) (כלומר, מחיקות, הוספות, כפילויות והיפוכים) ידועים כיום כממלאים תפקיד חשוב בווריאציה פנוטיפית, וכתוצאה מכך בתהליכים כגון קביעת מחלות או הסתגלות לסביבה חדשה. עם זאת, וריאנטים של נוקלאוטידים בודדים מקבלים הרבה יותר תשומת לב מאשר SVs, כנראה משום שקל יותר לזהות אותם, וההשפעות הפנוטיפיות שלהם קלות יותר לחיזוי. הפיתוח של טכנולוגיות ריצוף עמוק לקריאה קצרה וארוכה שיפר מאוד את הזיהוי של SVs, אך כימות התדירות שלהם מנתוני ריצוף מאוגד (poolseq) עדיין מורכב ויקר מבחינה טכנית.
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה וזולה למדי, המאפשרת לחוקרים לעקוב אחר הדינמיקה של תדירות אלל SV. כדוגמה ליישום, אנו עוקבים אחר התדירות של החדרת רצף החדרה (IS) באוכלוסיות אבולוציוניות ניסיוניות של חיידקים. שיטה זו מבוססת על תכנון שלישיות פריימרים סביב גבולות הווריאנטים המבניים, כך שהאמפליקונים המיוצרים על ידי הגברה של האללים מסוג פרא (WT) ונגזרים נבדלים בגודלם בלפחות 5%, וכי יעילות ההגברה שלהם דומה. הכמות של כל אמפליקון נקבעת על ידי אלקטרופורזה נימית מקבילה ומנורמלת לעקומת כיול. ניתן להרחיב שיטה זו בקלות לכימות התדירות של וריאנטים מבניים אחרים (מחיקות, כפילויות והיפוכים) ולגישות pool-seq של אוכלוסיות טבעיות, כולל אוכלוסיות פתוגנים בתוך המטופל.

באמצעות דנ"א שהופק משיבוט קדמון ושיבוט היפרמוטטור שבודד מאוכלוסיית S2.11 בדור 1,000, ביססנו את עקומת הכיול שמוצגת באיור 2. הפרופורציות המוטנטיות בפועל מתערובות דנ"א שהוכנו במעבדה ונמדדו על ידי מכשיר אלקטרופורזה נימית מקביל קושרו על ידי יחס ליניארי של שיפוע 1.0706, עם R2 של 0.970...

Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

פיתחנו שיטה חסכונית לעקוב אחר דינמיקת אלל פולימורפיזם של נוקלאוטידים שאינם יחידים, שניתן להתאים בקלות לארכיונים קפואים של אבולוציה ניסיונית. טכניקת PCR משולשת שולבה עם אלקטרופורזה אוטומטית מקבילית של נימים כדי לכמת את התדירות היחסית של אלל החדרה במהלך האבולוציה הניסויית.

מעקב אחר הדינמיקה של וריאנטים מבניים באוכלוסיות שהתפתחו בניסוי

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

וריאנטים מבניים כגון החדרות, מחיקות, כפילויות והיפוכים היו בעבר קשים יותר למעקב ניסיוני, ולא ניתן למדוד במדויק את התדרים שלהם על ידי ריצוף אמפליקון. כאן אנו מספקים טכניקה פשוטה וחסכונית, אשר משלבת עיצוב פריימר משולש ואלקטרופרזה נימית מקבילית כדי לעקוב אחר תדרי אלל משתנים מבניים לאורך זמן. שיטה זו נועדה להשלים את ריצוף נקודות הקצה באבולוציה הניסויית ולשחזר את התדרים של אללי דה נובו מתפתחים.אנו מקווים ששיטה זו תועיל גם לאלה העובדים עם נתוני פתוגן תוך מארחים. מי שתדגים את ההליך תהיה ז'אן המט, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו. השלבים השונים של השיטות יוצגו במקרה שבו האלל הנגזר נובע מהחדרת IS10 לגן חיידקי הנקרא mutS.ראשית, תכננו זוג פריימרים כדי להגביר אמפליקון קצר על האלל מסוג פרא סביב אתר החדרת המוטנטים. עצבו פריימר פריימר שלישי קדימה שניים בתוך רצף ההחדרה כדי ליצור משתנה גודל קל ממגבר הסוג הפראי. התחילו בחילוץ דנ"א מתרביות של 24 שעות ביממה של שיבוטים קבועים של אללים מסוג בר ומוטנטי.לאחר כימות הדנ"א, מדללים כל תמצית דנ"א לחמישה ננוגרם למיקרוליטר עם מים. תקן את שתי הדגימות ביחס של 50/50. הגדר תגובה של 20 מיקרוליטר המכילה 10 ננוגרם של דגימת DNA, פריימרים ותערובת מאסטר PCR.לאחר מכן, להפריד את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה, באמצעות ג'ל agarose 2%. יש לאמת את הבדלי הגודל בין האמפליקונים מהסוג הפראי לבין המוטציה על הג'ל. כדי לקבל עקומת כיול, התחילו בערבוב הדנ"א הפראי והדנ"א המוטנטי ביחסים שונים.לדלל את מוצרי PCR לריכוז של 0.1 ננוגרם למיקרוליטר. להכנת ג'ל ההפרדה, מערבבים את הג'ל הטרי והצבע. החלף את מאגר הכניסה.מקם את חיץ השטיפה במיקום המגירה הנכון של מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקביל. הוסף 22 מיקרוליטר של סמן מדלל לבארות של צלחת באר 96. עכשיו להוסיף שני מיקרוליטר של מוצרי PCR מדולל לכל מדגם היטב.לאחד ובכן, להוסיף סולם גודל DNA מתוך ערכת רגישות גבוהה, החל אחד עד 6, 000 זוגות בסיס בגודל. מקם את צלחת המיקרו במכשיר אלקטרופורזה נימית מקבילה בהפעלה נבחרת על תוכנת המכשיר. נתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים.ראשית, זהה את הפסגות על פי גודלן הידוע. כמת כל אמפליקון כדי ליצור עקומת כיול. לבסוף, ודא כי הכמויות היחסיות של שני האללים נמדדות כראוי.עקומת כיול זו משמשת לאחר מכן לחישוב כמות הווריאנטים המבניים לאחר הגברת PCR ואלקטרופורזה נימית מקבילית. תוצאות מייצגות אלה עוקבות אחר החדרה משבשת של הגן mutS. Knockdowns ו-mutS מובילים לפנוטיפ היפר-מוטטור, המאפשר לחיידקים לדגום יותר מוטציות משיעור המוטציות הבסיסי שלהם.באמצעות השיטה שהוצגה, בוצע מעקב אחר תדירות הווריאנטים המבניים mutS לאורך 1000 דורות. נחשף מסלול לא מונוטוני של האלל המוטנטי המתהווה. האלל המוטנטי זוהה לראשונה בדור 680.לאחר מכן האלל עלה במהירות בתדירותו, והגיע ל-67% בדור 713. עלייה זו קפאה על שמריה, וגדלה רק ב-10% במהלך 53 הדורות הבאים, ל-76%באופן בלתי צפוי, תדירות האלל המוטנטי ירדה אז מ-76% ל-49% במהלך 13 דורות, ולאחר מכן היא עלתה לקיבוע. שיטה זו תועיל לאלה העובדים על אבולוציה ניסיונית.פרוטוקול זה מאפשר למשתמש לקחת ארכיונים קפואים ולחקור מסלולים אבולוציוניים שאחרת לא ניתן לצפות בהם עם נתוני ריצוף נקודות קצה.

Research

JoVE Journal

Biology

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...