Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dall'ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) a S.B. I dati utilizzati in questo lavoro sono stati (parzialmente) prodotti attraverso le strutture tecniche GenSeq dell'Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier con il supporto di LabEx CeMEB, un programma ANR "Investissements d'avenir" (ANR-10-LABX-04-01).

L'impostazione di questo protocollo richiede una conoscenza precisa del punto di inserimento, cancellazione, inversione o duplicazione all'interno della sequenza ancestrale. Queste informazioni sono solitamente ottenute mediante sequenziamento dell'intero genoma (WGS) dei campioni finali o intermedi. Nel seguente protocollo, il principio generale per il caso di una mutazione di inserzione è dato per ogni fase, insieme a un caso rappresentativo in cui viene seguita la frequenza di un'inserzione IS10 nel gene mutS</em...

<ol>
	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

Qui, abbiamo proposto un metodo economico che consente di seguire la dinamica degli alleli SV adattativi emergenti nelle popolazioni evolutive sperimentali. Questo metodo combina le classiche tecniche di PCR e l'elettroforesi capillare parallela automatizzata, consentendo di determinare le quantità relative di due alleli. Una volta impostato, consente la quantificazione delle proporzioni alleliche in molti campioni in parallelo, ed è molto meno costoso del WGS. Questo metodo può essere visto come un equivalente del se...

Le varianti strutturali (SV) sono alterazioni della sequenza genomica, che generalmente colpiscono 50 bp o più. Le quattro categorie di SV descritte sono inserimenti di grandi dimensioni, grandi cancellazioni, inversioni e duplicazioni. Fino a poco tempo fa, è stata dedicata maggiore attenzione alle varianti a singolo nucleotide (SNV) che alle varianti strutturali, in termini di effetti fenotipici e del loro ruolo come determinanti genetici della malattia, o del loro contributo all'adattamento. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che è più facile rilevare gli SNV e prevederne gli effetti fenotipici. Tuttavia, le tecnologie di sequenziamento profondo a breve e lunga lettura hanno notevolmente migliorato la rilevazione delle SV, almeno in genomi singoli individuali o clonali1. Parallelamente, i loro effetti fenotipici sono stati meglio caratterizzati e sono stati documentati molti esempi della loro implicazione come determinanti genetici della malattia umana 2,3 o dell'adattamento ad un nuovo ambiente4.
Le delezioni e le inserzioni, spesso dovute a inserzioni di elementi genetici mobili (MGE), sono molto più dirompenti dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) e portano a mutazioni frameshift e modifiche della struttura proteica. Le delezioni e le inserzioni MGE all'interno dei geni provocano quasi sempre l'inattivazione genica, e le inserzioni in regioni non codificanti possono portare alla repressione o all'espressione costitutiva di geni adiacenti quando le sequenze di inserzione (IS) contengono sequenze promotrici o di terminazione5. Mentre il knockout di geni essenziali porta a chiari effetti dannosi sulla forma fisica batterica, la perdita di geni non essenziali è vantaggiosa in alcuni casi. Nonostante i loro costi intrinseci, le duplicazioni possono anche essere vantaggiose e partecipare all'adattamento in quanto portano a un cambiamento nel dosaggio genico; Un aumento dell'attività di una proteina specifica può essere vantaggioso a seconda delle condizioni6.
Le popolazioni di evoluzione sperimentale microbica sono di solito iniziate con cloni. Questa iniziale assenza di diversità genetica, combinata con la caratteristica dell'"ambiente chiuso" delle provette, porta a un potenziale molto limitato di evoluzione per guadagno genico attraverso il trasferimento genico orizzontale e la ricombinazione. In queste condizioni specifiche, il contributo all'adattamento di delezioni, duplicazioni e inserimento intragenomico di MGE è particolarmente importante; i batteri spesso si adattano attraverso mutazioni con perdita di funzione (principalmente a causa di delezioni o inserzioni di MGE), colpendo geni che non sono utiliin ambienti artificiali stabili, spesso ricchi di sostanze nutritive, 7. Nell'esperimento di evoluzione di E. coli più longevo, le inserzioni di IS150 sono particolarmente frequenti tra le popolazioni evolute dopo 50.000 generazioni, con elementi IS che rappresentano il 35% delle mutazioni che raggiungono un'alta frequenza nelle popolazioni che mantengono il loro tasso di mutazione del punto ancestrale8.
Gli studi di evoluzione e risequenziamento accoppiano l'evoluzione sperimentale e le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per studiare come i batteri si adattano, a livello fenotipico e genomico, a diverse condizioni ambientali e stress, come diverse fonti di carbonio ed energia, antibiotici e stress osmotico 9,10,11 . Questi studi tipicamente ottengono informazioni genomiche sulle popolazioni evolute o sui cloni solo nel punto finale sperimentale e, in alcuni casi, in un numero di punti temporali intermedi12,13,14. Questi dati forniscono informazioni sui geni e sui percorsi coinvolti nell'adattamento a un determinato ambiente, ma raramente consentono ai ricercatori di seguire le dinamiche degli alleli emergenti e ampi de novo nel tempo.
Un approccio per seguire queste dinamiche è quello di scegliere un numero limitato di alleli segreganti di interesse (a causa della funzione dei geni che influenzano, perché si muovono in parallelo in popolazioni indipendenti, ecc.) e utilizzare il sequenziamento amplico per quantificare la proporzione allelica, raggruppando molti punti temporali nella stessa sequenza15. Questo metodo è stato utilizzato con successo per seguire la dinamica di varianti di piccole dimensioni (SNPs o 1 bp indels) in16 e17 popolazioni naturali di microbi. Tuttavia, nel caso di indels più grandi o inserimenti MGE, la differenza di dimensioni degli ampliconi induce differenze di efficienza PCR, che distorcono la relazione tra proporzioni leggere e alleliche. In alcuni casi, la differenza di dimensioni tra i due alleli è superiore alla lunghezza classica dell'amplicone. Qui, abbiamo accoppiato una tecnica di tripletta PCR con elettroforesi capillare parallela automatizzata per quantificare la frequenza relativa di un allele di inserzione in base alla discriminazione delle dimensioni. Questo approccio consente lo sfruttamento di punti temporali sperimentali sottoutilizzati per determinare la dinamica di un allele mutante emergente e per seguire la sua frequenza di fissazione o perdita, in modo economicamente vantaggioso. Abbiamo applicato questo metodo per tracciare gli alleli mutS emergenti, mutati attraverso un'inserzione IS10, fornendo al genotipo mutato un fenotipo ipermutatore.
Questo metodo richiede due alleli bersaglio con una differenza di dimensioni del ≥5%. In primo luogo, le triplette di primer sono progettate per produrre frammenti di dimensioni simili, che condividono un primer comune. In secondo luogo, le condizioni di PCR sono ottimizzate e viene prodotta una curva di calibrazione utilizzando miscele di gDNA wild-type (WT) e mutante. Infine, i campioni vengono amplificati mediante PCR e la frequenza relativa di ciascun allele viene quantificata mediante elettroforesi capillare quantitativa parallela.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

Le varianti strutturali (SV) (cioè delezioni, inserzioni, duplicazioni e inversioni) sono ora note per svolgere un ruolo importante nella variazione fenotipica e, di conseguenza, in processi come la determinazione della malattia o l'adattamento a un nuovo ambiente. Tuttavia, le varianti a singolo nucleotide ricevono molta più attenzione delle SV, probabilmente perché sono più facili da rilevare e i loro effetti fenotipici sono più facili da prevedere. Lo sviluppo di tecnologie di sequenziamento profondo a breve e lunga lettura ha notevolmente migliorato il rilevamento delle SV, ma la quantificazione della loro frequenza dai dati di sequenziamento aggregato (poolseq) è ancora tecnicamente complessa e costosa.
Qui, presentiamo un metodo piuttosto semplice ed economico, che consente ai ricercatori di seguire la dinamica della frequenza dell'allele SV. Come esempio di applicazione, seguiamo la frequenza di inserimento di una sequenza di inserzione (IS) nelle popolazioni sperimentali evolutive di batteri. Questo metodo si basa sulla progettazione di triplette di primer attorno ai bordi delle varianti strutturali, in modo tale che gli ampliconi prodotti dall'amplificazione del wild-type (WT) e degli alleli derivati differiscano in dimensioni di almeno il 5% e che la loro efficienza di amplificazione sia simile. La quantità di ciascun amplicone viene quindi determinata mediante elettroforesi capillare parallela e normalizzata a una curva di calibrazione. Questo metodo può essere facilmente esteso alla quantificazione della frequenza di altre varianti strutturali (delezioni, duplicazioni e inversioni) e agli approcci pool-seq di popolazioni naturali, comprese le popolazioni patogene all'interno dei pazienti.

Utilizzando il DNA estratto da un clone ancestrale e un clone ipermutatore isolato dalla popolazione S2.11 alla generazione 1.000, abbiamo stabilito la curva di calibrazione mostrata in Figura 2. Le proporzioni effettive dei mutanti provenienti da miscele di DNA preparate in laboratorio e misurate dallo strumento di elettroforesi capillare parallela sono state collegate da una relazione lineare di pendenza 1,0706, con un R2 di 0,9705. Inoltre, c'era un buon accordo tra le repliche...

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Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Abbiamo sviluppato un metodo economico per seguire la dinamica allelica del polimorfismo non a singolo nucleotide che può essere facilmente adattata agli archivi congelati dell'evoluzione sperimentale. Una tecnica di tripletta PCR è stata accoppiata con elettroforesi capillare parallela automatizzata per quantificare la frequenza relativa di un allele di inserzione nel corso dell'evoluzione sperimentale.

Seguire la dinamica delle varianti strutturali in popolazioni evolute sperimentalmente

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Le varianti strutturali come inserzioni, delezioni, duplicazioni e inversioni sono state in passato più difficili da seguire sperimentalmente e le loro frequenze non possono essere misurate con precisione dal sequenziamento dell'amplicone. Qui forniamo una tecnica semplice ed economica, che accoppia il design del primer triplo e l'elettroferesi capillare parallela per seguire le frequenze degli alleli varianti strutturali nel tempo. Questo metodo è stato progettato per integrare il sequenziamento degli endpoint nell'evoluzione sperimentale e per ritracciare le frequenze degli alleli de novo emergenti.Speriamo che questo metodo possa anche avvantaggiare coloro che lavorano con i dati sui patogeni intra ospiti. A dimostrare la procedura sarà Jeanne Hamet, assistente di ricerca del nostro laboratorio. Le diverse fasi dei metodi saranno mostrate in un caso in cui l'allele derivato risulta da un'inserzione IS10 in un gene batterico chiamato mutS.Per prima cosa progetta una coppia di primer per amplificare un breve amplicone sull'allele wild type attorno al sito di inserimento mutante. Progettare un terzo primer forward primer due all'interno della sequenza di inserimento per produrre una leggera variabile di dimensione dall'amplicone wild type. Inizia estraendo il DNA da colture di 24 ore di cloni allelici selvatici e mutanti fissi.Dopo aver quantificato il DNA, diluire ogni estratto di DNA a cinque nanogrammi per microlitro con acqua. Fissare i due campioni in un rapporto 50/50. Impostare una reazione da 20 microlitri contenente 10 nanogrammi di campione di DNA, primer e master mix PCR.Quindi, separare il prodotto PCR mediante elettroforesi, utilizzando un gel di agarosio al 2%. La differenza di dimensioni tra gli ampliconi del tipo selvatico e il mutante deve essere verificata sul gel. Per ottenere una curva di calibrazione, iniziare mescolando il DNA wild type e il DNA mutante in vari rapporti.Diluire i prodotti PCR a 0,1 nanogrammi per concentrazione di microlitro. Per preparare il gel di separazione, mescolare il gel fresco e colorare. Sostituire il buffer di ingresso.Posizionare il tampone di risciacquo nella corretta posizione del cassetto dello strumento di elettroforesi capillare parallelo. Aggiungere 22 microlitri del marcatore di diluente ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Ora aggiungi due microlitri di prodotti PCR diluiti a ciascun pozzetto del campione.A uno Bene, aggiungi una scala di dimensioni del DNA da un kit ad alta sensibilità, che va da una a 6.000 coppie di basi di dimensioni. Posizionare la micropiastra nello strumento di elettroforesi capillare parallela in esecuzione selezionata sul software dello strumento. Analizza i risultati utilizzando il software di analisi dei dati.Innanzitutto, identifica i picchi in base alle loro dimensioni note. Quantificare ogni amplicone per produrre una curva di calibrazione. Infine, verificare che le quantità relative dei due alleli siano misurate correttamente.Questa curva di calibrazione viene quindi utilizzata per calcolare la quantità di varianti strutturali dopo l'amplificazione PCR e l'elettroforesi capillare parallela. Questi risultati rappresentativi seguono un'inserzione dirompente nel gene mutS. Knockdown e mutS portano a un fenotipo ipermutatore, consentendo ai batteri di campionare più mutazioni rispetto al loro tasso di mutazione di base.Utilizzando il metodo presentato, la frequenza della variante strutturale mutS è stata tracciata attraverso 1000 generazioni. È stata rivelata una traiettoria non monotona dell'allele mutante emergente. L'allele mutante è stato rilevato per la prima volta alla generazione 680.L'allele è poi aumentato rapidamente in frequenza, raggiungendo il 67% dalla generazione 713. Questo aumento è poi rimasto stagnante, aumentando solo del 10% nelle successive 53 generazioni, al 76% Inaspettatamente, la frequenza dell'allele mutante è poi diminuita dal 76% al 49% nel corso di 13 generazioni, dopo di che è aumentata fino alla fissazione. Questo metodo andrà a beneficio di coloro che lavorano sull'evoluzione sperimentale.Questo protocollo consente all'utente di prendere archivi congelati ed esplorare traiettorie evolutive che altrimenti non sarebbero osservabili con i dati di sequenziamento degli endpoint.

Research

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Biology

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