Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) til S.B. Data som ble brukt i dette arbeidet ble (delvis) produsert gjennom GenSeq tekniske fasiliteter ved Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier med støtte fra LabEx CeMEB, et ANR "Investissements d'avenir" -program (ANR-10-LABX-04-01).

Å sette opp denne protokollen krever presis kunnskap om innsettings-, slettings-, inversjons- eller dupliseringspunktet i forfedresekvensen. Denne informasjonen oppnås vanligvis ved helgenomsekvensering (WGS) av ende- eller mellompunktprøvene. I den følgende protokollen er det generelle prinsippet for tilfelle av en innsettingsmutasjon gitt for hvert trinn, sammen med et representativt tilfelle hvor frekvensen av en IS10-innsetting i mutS-genet i en eksperimentell evolusjonspopulasjon av E. coli fø...

<ol>
	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846 (2014).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence.">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li><li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability.">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li><li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria.">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li><li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature.">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li><li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria.">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).</li><li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer.">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects.">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li><li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2,000+generations.">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50,000-generation+experiment.">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li><li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

Her har vi foreslått en kostnadseffektiv metode som gjør det mulig å følge dynamikken til nye adaptive SV-alleler i eksperimentelle evolusjonspopulasjoner. Denne metoden kobler klassiske PCR-teknikker og automatisert parallell kapillær elektroforese, slik at de relative mengdene av to alleler kan bestemmes. Når den er satt opp, tillater den kvantifisering av allelproporsjoner i mange prøver parallelt, og er mye billigere enn WGS. Denne metoden kan sees på som en ekvivalent med amplikonsekvensering for ikke-SNP-mu...

Strukturelle varianter (SV) er endringer i den genomiske sekvensen, som vanligvis påvirker 50 bp eller mer. De fire kategoriene av beskrevne SV er store innsettinger, store slettinger, inversjoner og dupliseringer. Inntil nylig har mer oppmerksomhet blitt viet til enkeltnukleotidvarianter (SNV) enn til strukturelle varianter, når det gjelder deres fenotypiske effekter og deres rolle som genetiske determinanter for sykdom, eller deres bidrag til tilpasning. Dette er sannsynligvis fordi det er lettere å både oppdage SNV og forutsi deres fenotypiske effekter. Imidlertid har kort- og langleste dypsekvenseringsteknologier sterkt forbedret deteksjonen av SV, i det minste i enkeltindivider eller klonale genomer1. Parallelt har deres fenotypiske effekter blitt bedre karakterisert, og mange eksempler på deres implikasjoner som genetiske determinanter for menneskelig sykdom 2,3 eller tilpasning til et nytt miljø4 har blitt dokumentert.
Delesjoner og innsettinger, ofte på grunn av mobile genetiske element (MGE) innsettinger, er mye mer forstyrrende enn enkeltnukleotidpolymorfismer (SNPs) og fører til frameshift-mutasjoner og proteinstrukturendringer. Delesjoner og MGE-innsettinger i gener resulterer nesten alltid i geninaktivering, og innsettinger i ikke-kodende regioner kan føre til undertrykkelse eller konstitutivt uttrykk for tilstøtende gener når innsettingssekvenser (IS) inneholder promotor- eller termineringssekvenser5. Mens knockout av essensielle gener fører til klare skadelige effekter på bakteriell kondisjon, er tapet av ikke-essensielle gener gunstig i noen tilfeller. Til tross for deres iboende kostnader, kan dupliseringer også være fordelaktige, og delta i tilpasning da de fører til endring i gendosering; En økning i aktiviteten til et spesifikt protein kan være fordelaktig avhengig av forholdene6.
Mikrobielle eksperimentelle evolusjonspopulasjoner er vanligvis startet med kloner. Dette innledende fraværet av genetisk mangfold, kombinert med det "lukkede miljøet" som er karakteristisk for reagensrør, fører til et svært begrenset potensial for evolusjon ved gengevinst gjennom horisontal genoverføring og rekombinasjon. Under disse spesifikke forholdene er bidraget til tilpasning av delesjoner, dupliseringer og intragenomisk MGE-innsetting spesielt viktig; bakterier tilpasser seg ofte gjennom funksjonstapsmutasjoner (hovedsakelig på grunn av delesjoner eller MGE-innsettinger), og påvirker gener som ikke er nyttige i stabile, ofte næringsrike, monokulturkunstige miljøer7. I det lengste pågående E. coli-evolusjonseksperimentet er IS150-innsettinger spesielt hyppige blant populasjoner utviklet etter 50 000 generasjoner, med IS-elementer som representerer 35% av mutasjoner som når høy frekvens i populasjoner som beholder sin forfedre punktmutasjonsrate8.
Evolve and resequence studies kobler eksperimentell evolusjon og neste generasjons sekvensering (NGS) teknologier for å undersøke hvordan bakterier tilpasser seg, på fenotypisk og genomisk nivå, til forskjellige miljøforhold og påkjenninger, for eksempel forskjellige karbon- og energikilder, antibiotika og osmotisk stress 9,10,11 . Disse studiene får vanligvis genomisk informasjon om de utviklede populasjonene eller klonene utelukkende ved det eksperimentelle endepunktet, og i noen tilfeller ved en rekke mellomliggende tidspunkter12,13,14. Disse dataene gir innsikt i gener og veier involvert i tilpasningen til et gitt miljø, men tillater sjelden forskere å følge dynamikken i de novo nye og feiende alleler over tid.
En tilnærming til å følge denne dynamikken er å velge et begrenset antall segregerende alleler av interesse (på grunn av funksjonen til genene de påvirker, fordi de feier parallelt i uavhengige populasjoner, etc.) og bruker amplikonsekvensering for å kvantifisere allelandelen, og samle mange tidspunkter i samme sekvenseringskjøring15. Denne metoden har blitt brukt til å følge dynamikken til små størrelsesvarianter (SNPs eller 1 bp indels) i eksperimentelle16 og naturlige17 populasjoner av mikrober. Imidlertid, når det gjelder større indels eller MGE-innsettinger, induserer størrelsesforskjellen til ampliconene PCR-effektivitetsforskjeller, noe som forvrenger forholdet mellom lese- og allelproporsjoner. I visse tilfeller er størrelsesforskjellen mellom de to allelene bedre enn den klassiske lengden på forsterkeren. Her koblet vi en triplett-PCR-teknikk med automatisert parallell kapillær elektroforese for å kvantifisere den relative frekvensen av et innsettingsallel basert på størrelsesdiskriminering. Denne tilnærmingen tillater utnyttelse av underutnyttede eksperimentelle tidspunkter for å bestemme dynamikken til et fremvoksende mutant allel og å følge frekvensen til fiksering eller tap, på en kostnadseffektiv måte. Vi brukte denne metoden for å spore nye mutS-alleler, mutert gjennom en IS10-innsetting, og ga den muterte genotypen en hypermutatorfenotype.
Denne metoden krever to målalleler med en ≥5% forskjell i størrelse. For det første er primer tripletter designet for å produsere tilsvarende størrelse fragmenter, som deler en felles primer. For det andre optimaliseres PCR-forholdene, og en kalibreringskurve produseres ved hjelp av blandinger av villtype (WT) og mutant gDNA. Til slutt forsterkes prøvene ved PCR, og den relative frekvensen av hvert allel kvantifiseres ved parallell kvantitativ kapillær elektroforese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

Strukturelle varianter (SV) (dvs. delesjoner, innsettinger, dupliseringer og inversjoner) er nå kjent for å spille en viktig rolle i fenotypisk variasjon, og følgelig i prosesser som sykdomsbestemmelse eller tilpasning til et nytt miljø. Imidlertid får enkeltnukleotidvarianter mye mer oppmerksomhet enn SV, sannsynligvis fordi de er lettere å oppdage, og deres fenotypiske effekter er lettere å forutsi. Utviklingen av kort- og langleste dypsekvenseringsteknologier har sterkt forbedret deteksjonen av SV-er, men kvantifiseringen av frekvensen fra poolseqing-data (poolseq) er fortsatt teknisk komplisert og kostbar.
Her presenterer vi en ganske enkel og billig metode, som gjør det mulig for forskere å følge dynamikken i SV-allelfrekvensen. Som et eksempel på anvendelse følger vi frekvensen av en innsettingssekvens (IS) innsetting i eksperimentelle evolusjonspopulasjoner av bakterier. Denne metoden er basert på utforming av tripletter av primere rundt strukturvariantgrensene, slik at amplikonene produsert ved amplifisering av villtypen (WT) og avledede alleler varierer i størrelse med minst 5%, og at deres amplifikasjonseffektivitet er lik. Mengden av hver amplikon bestemmes deretter av parallell kapillær elektroforese og normaliseres til en kalibreringskurve. Denne metoden kan enkelt utvides til kvantifisering av frekvensen av andre strukturelle varianter (delesjoner, dupliseringer og inversjoner) og til pool-seq-tilnærminger av naturlige populasjoner, inkludert patogenpopulasjoner innenfor.

Ved å bruke DNA ekstrahert fra en forfedreklon og en hypermutatorklon isolert fra S2.11-populasjonen ved generasjon 1,000, etablerte vi kalibreringskurven vist i figur 2. De faktiske mutantproporsjonene fra laboratoriefremstilte DNA-blandinger og målt ved det parallelle kapillære elektroforeseinstrumentet ble koblet sammen av et lineært forhold mellom helning 1,0706, med en R2 på 0,9705. I tillegg var det en god overensstemmelse mellom biologiske replikater; Standardavviket v...

Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Vi utviklet en kostnadseffektiv metode for å følge ikke-enkelt nukleotidpolymorfisme alleldynamikk som lett kan tilpasses eksperimentelle evolusjonsfrosne arkiver. En triplett-PCR-teknikk ble kombinert med automatisert parallell kapillær elektroforese for å kvantifisere den relative frekvensen av et innsettingsallel i løpet av eksperimentell evolusjon.

følge dynamikken til strukturelle varianter i eksperimentelt utviklede populasjoner

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Strukturelle varianter som innsettinger, delesjoner, dupliseringer og inversjoner har tidligere vært vanskeligere å følge eksperimentelt, og frekvensene deres kan ikke måles nøyaktig ved amplikonsekvensering. Her gir vi en enkel kostnadseffektiv teknikk, som kobler triplikat primerdesign og parallell kapillær elektroferese for å følge strukturelle variantallelfrekvenser over tid. Denne metoden ble designet for å komplementere endepunktsekvensering i eksperimentell evolusjon og for å spore frekvensene til nye de novo alleler.Vi håper denne metoden også vil være til nytte for de som arbeider med patogendata fra intraverter. Demonstrere prosedyren vil være Jeanne Hamet, en forskningsassistent fra vårt laboratorium. De forskjellige trinnene i metodene vil bli vist i et tilfelle hvor det avledede allelet er et resultat av en IS10-innsetting i et bakteriegen kalt mutS.Først designer du et par primere for å forsterke en kort amplikon på villtypeallelen rundt det mutante innføringsstedet. Design en tredje primer forward primer to innenfor innsettingssekvensen for å produsere en liten størrelsesvariabel fra villtypeforsterkeren. Begynn med å ekstrahere DNA fra 24-timers kulturer av fast villtype og mutante allelkloner.Etter å ha kvantifisert DNA, fortynn hvert DNA-ekstrakt til fem nanogram per mikroliter med vann. Fiks de to prøvene i et 50/50-forhold. Sett opp en 20-mikroliters reaksjon som inneholder 10 nanogram DNA-prøve, primere og PCR-masterblanding.Deretter skiller du PCR-produktet ved elektroforese ved hjelp av en 2% agarosegel. Størrelsesforskjellen mellom forsterkerne fra den ville typen og mutanten må verifiseres på gelen. For å oppnå en kalibreringskurve, begynn med å blande DNA av vill type og mutant DNA i forskjellige forhold.Fortynn PCR-produktene til 0,1 nanogram per mikroliter konsentrasjon. For å forberede separasjonsgelen, bland den friske gelen og fargestoffet. Bytt ut innløpsbufferen.Plasser skyllebufferen i riktig skuffplassering av det parallelle kapillære elektroforeseinstrumentet. Tilsett 22 mikroliter av fortynningsmarkøren til brønnene på en 96 brønnplate. Legg nå to mikroliter av de fortynnede PCR-produktene til hver prøvebrønn.Til en Vel, legg til en DNA-størrelse stige fra et høyfølsomhetssett, alt fra en til 6.000 basepar i størrelse. Plasser mikroplaten i instrumentet med parallell kapillær elektroforese i utvalgt kjøring på instrumentprogramvaren. Analyser resultatene ved hjelp av dataanalyseprogramvaren.Først må du identifisere toppene basert på deres kjente størrelse. Kvantifiser hver amplikon for å produsere en kalibreringskurve. Til slutt må du kontrollere at de relative mengdene av de to allelene er korrekt målt.Denne kalibreringskurven brukes deretter til å beregne mengden strukturelle varianter etter PCR-amplifikasjon og parallell kapillær elektroforese. Disse representative resultatene følger en forstyrrende innsetting i mutS-genet. Knockdowns og mutS fører til en hypermutator fenotype, slik at bakterier kan prøve flere mutasjoner enn deres base mutasjonsrate.Ved hjelp av metoden som ble presentert, ble mutS-strukturvariantfrekvensen sporet over 1000 generasjoner. En ikke-monoton bane av det fremvoksende mutante allelet ble avslørt. Det muterte allelet ble først påvist i generasjon 680.Allelen økte deretter raskt i frekvens og nådde 67 % innen generasjon 713. Denne økningen stagnerte deretter og økte bare 10% i løpet av de neste 53 generasjonene, til 76%Uventet sank frekvensen av mutant allel fra 76% til 49% i løpet av 13 generasjoner, hvoretter den økte til fiksering. Denne metoden vil være til nytte for de som jobber med eksperimentell evolusjon.Denne protokollen lar brukeren ta frosne arkiver og utforske evolusjonære baner som ellers ikke kan observeres med endepunktsekvenseringsdata.

Research

JoVE Journal

Biology

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studerer proteolyse av Cyclin B på Single Cell nivå i hele cellepopulasjoner

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv Capture av 5-hydroxymethylcytosine fra genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isolere forsterkes Hsp104 Varianter Bruke gjær Proteinopathy modeller

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studere Ribonucleotide inkorporering: Strand-spesifikke påvisning av Ribonucleotides i gjær genomet og måler Ribonucleotide-indusert mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live Cell Imaging å vurdere dynamikken i Metafase timing og Cell Fate etter mitotisk spindel forstyrrelser

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...