Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) para S.B. Os dados utilizados neste trabalho foram (parcialmente) produzidos através das instalações técnicas GenSeq do Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier com o apoio do LabEx CeMEB, um programa ANR "Investissements d'avenir" (ANR-10-LABX-04-01).

A configuração deste protocolo requer conhecimento preciso do ponto de inserção, exclusão, inversão ou duplicação dentro da sequência ancestral. Essas informações são geralmente obtidas por sequenciamento do genoma completo (WGS) das amostras de ponto final ou intermediário. No protocolo a seguir, o princípio geral para o caso de uma mutação de inserção é dado para cada etapa, juntamente com um caso representativo em que a frequência de uma inserção de IS10 no gene mutS em uma população d...

<ol>
	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846 (2014).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence.">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li><li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability.">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li><li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria.">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li><li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature.">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li><li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria.">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).</li><li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer.">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects.">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li><li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2,000+generations.">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50,000-generation+experiment.">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li><li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

Aqui, propusemos um método custo-efetivo que permite acompanhar a dinâmica de alelos emergentes adaptativos de VS em populações de evolução experimental. Este método combina técnicas clássicas de PCR e eletroforese capilar paralela automatizada, permitindo determinar as quantidades relativas de dois alelos. Uma vez configurado, permite a quantificação das proporções alélicas em muitas amostras em paralelo, sendo muito menos dispendioso que o WGS. Este método pode ser visto como um equivalente ao sequenciam...

Variantes estruturais (SVs) são alterações da sequência genômica, geralmente afetando 50 pb ou mais. As quatro categorias de SVs descritas são grandes inserções, grandes deleções, inversões e duplicações. Até recentemente, mais atenção tem sido dedicada às variantes de nucleotídeo único (SNVs) do que às variantes estruturais, em termos de seus efeitos fenotípicos e seu papel como determinantes genéticos da doença, ou sua contribuição para a adaptação. Isso provavelmente ocorre porque é mais fácil detectar SNVs e prever seus efeitos fenotípicos. No entanto, tecnologias de sequenciamento profundo de leitura curta e longa têm melhorado fortemente a detecção de SVs, pelo menos em genomas individuais ou clonais1. Paralelamente, seus efeitos fenotípicos têm sido melhor caracterizados, e muitos exemplos de sua implicação como determinantes genéticos de doenças humanas 2,3 ou adaptação a um novo ambiente4 têm sido documentados.
Deleções e inserções, muitas vezes devido a inserções de elementos genéticos móveis (MGE), são muito mais disruptivas do que polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e levam a mutações frameshift e modificações na estrutura de proteínas. Deleções e inserções de MGE dentro de genes quase sempre resultam em inativação gênica, e inserções em regiões não codificantes podem levar à repressão ou expressão constitutiva de genes adjacentes quando sequências de inserção (ISs) contêmsequências promotoras ou terminativas5. Enquanto o nocaute de genes essenciais leva a efeitos prejudiciais claros sobre a aptidão bacteriana, a perda de genes não essenciais é benéfica em alguns casos. Apesar de seus custos inerentes, as duplicações também podem ser vantajosas e participar da adaptação, pois levam a uma mudança na dosagem gênica; Um aumento na atividade de uma proteína específica pode ser vantajoso dependendo das condições6.
Populações de evolução microbiana experimental são geralmente iniciadas com clones. Esta ausência inicial de diversidade genética, combinada com o "ambiente fechado" característico dos tubos de ensaio, leva a um potencial muito limitado de evolução por ganho gênico através da transferência horizontal de genes e recombinação. Nessas condições específicas, a contribuição para a adaptação de deleções, duplicações e inserção intragenômica de MGE é particularmente importante; as bactérias frequentemente se adaptam através de mutações de perda de função (principalmente devido a deleções ou inserções de MGE), afetando genes que não são úteis em ambientes artificiais estáveis, muitas vezes ricos em nutrientes, de monocultura7. No mais longo experimento de evolução de E. coli , as inserções de IS150 são particularmente frequentes entre populações evoluídas após 50.000 gerações, com elementos de SI representando 35% das mutações que atingem alta frequência em populações que mantêm sua taxa de mutação de ponto ancestral8.
Estudos de evolução e reseqüenciamento acoplam evolução experimental e tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) para investigar como as bactérias se adaptam, em nível fenotípico e genômico, a diferentes condições e estresses ambientais, como diferentes fontes de carbono e energia, antibióticose estresse osmótico9,10,11 . Esses estudos tipicamente obtêm informações genômicas sobre as populações ou clones evoluídos apenas no desfecho experimental e, em alguns casos, em vários momentos intermediários12,13,14. Esses dados fornecem informações sobre genes e caminhos envolvidos na adaptação a um determinado ambiente, mas raramente permitem que os pesquisadores acompanhem a dinâmica de alelos emergentes e abrangentes ao longo do tempo.
Uma abordagem para seguir essas dinâmicas é escolher um número limitado de alelos segregantes de interesse (por causa da função dos genes que eles afetam, porque eles varrem em paralelo em populações independentes, etc.) e usar o sequenciamento de amplicon para quantificar a proporção alélica, agrupando muitos pontos de tempo na mesma sequenciamento15. Este método tem sido usado com sucesso para acompanhar a dinâmica de variantes de tamanho pequeno (SNPs ou indels de 1 pb) em populações experimentais de16 e17 micróbios naturais. No entanto, no caso de indels maiores ou inserções de MGE, a diferença de tamanho dos amplicons induz diferenças de eficiência de PCR, que distorcem a relação entre as proporções de leitura e alelo. Em certos casos, a diferença de tamanho entre os dois alelos é superior ao comprimento clássico do amplicon. Aqui, acoplamos uma técnica de PCR triplete com eletroforese capilar paralela automatizada para quantificar a frequência relativa de um alelo de inserção com base na discriminação de tamanho. Esta abordagem permite a exploração de pontos de tempo experimentais subutilizados para determinar a dinâmica de um alelo mutante emergente e acompanhar sua frequência de fixação ou perda, de maneira custo-efetiva. Nós aplicamos este método para rastrear alelos mutS- emergentes, mutados através de uma inserção IS10, fornecendo ao genótipo mutado um fenótipo hipermutador.
Este método requer dois alelos-alvo com uma diferença de ≥5% no tamanho. Primeiro, os trigêmeos de primer são projetados para produzir fragmentos de tamanho semelhante, que compartilham um primer comum. Em segundo lugar, as condições de PCR são otimizadas, e uma curva de calibração é produzida usando misturas de gDNA selvagem (WT) e mutante. Finalmente, as amostras são amplificadas por PCR, e a frequência relativa de cada alelo é quantificada por eletroforese capilar quantitativa paralela.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

Sabe-se agora que as variantes estruturais (SVs) (ou seja, deleções, inserções, duplicações e inversões) desempenham um papel importante na variação fenotípica e, consequentemente, em processos como determinação de doenças ou adaptação a um novo ambiente. No entanto, as variantes de nucleotídeo único recebem muito mais atenção do que as SVs, provavelmente porque são mais fáceis de detectar e seus efeitos fenotípicos são mais fáceis de prever. O desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento profundo de leitura curta e longa melhorou fortemente a detecção de SVs, mas a quantificação de sua frequência a partir de dados de sequenciamento agrupado (poolseq) ainda é tecnicamente complexa e cara.
Aqui, apresentamos um método bastante simples e de baixo custo, que permite aos pesquisadores acompanhar a dinâmica da frequência alélica do VS. Como exemplo de aplicação, seguimos a frequência de inserção de uma sequência de inserção (SI) em populações de evolução experimental de bactérias. Este método é baseado no planejamento de trigêmeos de primers ao redor das bordas variantes estruturais, de modo que os amplicons produzidos pela amplificação do wild-type (WT) e alelos derivados diferem em tamanho em pelo menos 5%, e que sua eficiência de amplificação é semelhante. A quantidade de cada amplicon é então determinada por eletroforese capilar paralela e normalizada para uma curva de calibração. Este método pode ser facilmente estendido para a quantificação da frequência de outras variantes estruturais (deleções, duplicações e inversões) e para abordagens pool-seq de populações naturais, incluindo populações de patógenos intra-pacientes.

Usando DNA extraído de um clone ancestral e um clone hipermutador isolado da população S2.11 na geração 1.000, estabeleceu-se a curva de calibração mostrada na Figura 2. As proporções reais de mutantes a partir de misturas de DNA preparadas em laboratório e medidas pelo instrumento de eletroforese capilar paralela foram ligadas por uma relação linear de inclinação 1,0706, com um R2 de 0,9705. Além disso, houve boa concordância entre as réplicas biológicas; O desv...

Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Desenvolvemos um método custo-efetivo para acompanhar a dinâmica alélica de polimorfismo de nucleotídeo não único que pode ser facilmente adaptado à evolução experimental de arquivos congelados. Uma técnica de triplet PCR foi acoplada à eletroforese capilar paralela automatizada para quantificar a frequência relativa de um alelo de inserção ao longo da evolução experimental.

Acompanhando a Dinâmica de Variantes Estruturais em Populações Experimentalmente Evoluídas

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Variantes estruturais como inserções, deleções, duplicações e inversões foram no passado mais difíceis de seguir experimentalmente, e suas frequências não podem ser medidas com precisão por sequenciamento de ampliação. Aqui nós fornecemos uma técnica simples e econômica, que combina o design do primer triplicado e a eletroferese capilar paralela para seguir as frequências alélicas variantes estruturais ao longo do tempo. Este método foi projetado para complementar o sequenciamento de desfechos na evolução experimental e para retraçar as frequências de alelos emergentes de novo.Esperamos que este método também beneficie aqueles que trabalham com dados intra-hospedeiros de patógenos. Quem demonstrará o procedimento será Jeanne Hamet, assistente de pesquisa do nosso laboratório. As diferentes etapas dos métodos serão mostradas em um caso em que o alelo derivado resulta de uma inserção de IS10 em um gene bacteriano chamado mutS.Primeiro projete um par de primers para amplificar um amplicon curto no alelo do tipo selvagem ao redor do local de inserção mutante. Projete um terceiro primer forward primer two dentro da sequência de inserção para produzir uma pequena variável de tamanho a partir do amplicon do tipo selvagem. Comece extraindo DNA de culturas de 24 horas de clones de alelos selvagens e mutantes fixos.Depois de quantificar o DNA, diluir cada extrato de DNA para cinco nanogramas por microlitro com água. Fixe as duas amostras em uma proporção de 50/50. Configure uma reação de 20 microlitros contendo 10 nanogramas de amostra de DNA, primers e mistura mestre de PCR.Em seguida, separar o produto da PCR por eletroforese, usando um gel de agarose a 2%. A diferença de tamanho entre os amplicons do tipo selvagem e do mutante deve ser verificada no gel. Para obter uma curva de calibração, comece misturando o DNA do tipo selvagem e o DNA mutante em várias proporções.Diluir os produtos de PCR para 0,1 nanogramas por concentração de microlitro. Para preparar o gel de separação, misture o gel fresco e o corante. Substitua o buffer de entrada.Coloque o tampão de enxágue na gaveta correta do instrumento de eletroforese capilar paralela. Adicione 22 microlitros do marcador diluente aos poços de uma placa de 96 poços. Agora adicione dois microlitros dos produtos de PCR diluídos a cada poço de amostra.A um poço, adicione uma escada de tamanho de DNA de um kit de alta sensibilidade, variando de um a 6.000 pares de base de tamanho. Coloque a microplaca no instrumento de eletroforese capilar paralela em execução selecionada no software do instrumento. Analise os resultados utilizando o software de análise de dados.Primeiro, identifique os picos com base em seu tamanho conhecido. Quantifique cada amplicon para produzir uma curva de calibração. Finalmente, verifique se as quantidades relativas dos dois alelos estão corretamente medidas.Esta curva de calibração é então usada para calcular a quantidade de variantes estruturais após amplificação por PCR e eletroforese capilar paralela. Estes resultados representativos seguem uma inserção disruptiva no gene mutS. Knockdowns e mutS levam a um fenótipo hipermutador, permitindo que as bactérias apareçam mais mutações do que sua taxa de mutação base.Usando o método apresentado, a frequência da variante estrutural mutS foi rastreada ao longo de 1000 gerações. Uma trajetória não monotônica do alelo mutante emergente foi revelada. O alelo mutante foi detectado pela primeira vez na geração 680.O alelo então aumentou rapidamente em frequência, atingindo 67% na geração 713. Este aumento então estagnou, aumentando apenas 10% nas 53 gerações seguintes, para 76% Inesperadamente, a frequência do alelo mutante diminuiu de 76% para 49% ao longo de 13 gerações, após o que aumentou para fixação. Este método beneficiará aqueles que trabalham com evolução experimental.Esse protocolo permite que o usuário pegue arquivos congelados e explore trajetórias evolutivas que, de outra forma, não são observáveis com dados de sequenciamento de endpoint.

Research

JoVE Journal

Biology

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Entrevista: HIV-1 DNA proviral Excisão Usando um Recombinase Evolved

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Biologia

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de populações de células no tecido humano único post-mortem do cérebro

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isolando potencializado Hsp104 variantes usando levedura Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...