Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Эта работа была поддержана ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) для S.B. Данные, использованные в этой работе, были (частично) получены с помощью технических средств GenSeq Института наук эволюции Монпелье при поддержке LabEx CeMEB, программы ANR «Investissements d'avenir» (ANR-10-LABX-04-01).

Настройка этого протокола требует точного знания точки вставки, удаления, инверсии или дублирования в наследственной последовательности. Эта информация обычно получается путем полногеномного секвенирования (WGS) конечных или промежуточных точечных образцов. В следующем протоколе общ...

<ol>
	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846 (2014).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence.">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li><li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability.">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li><li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria.">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li><li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature.">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li><li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria.">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).</li><li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer.">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects.">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li><li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2,000+generations.">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50,000-generation+experiment.">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li><li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

Здесь мы предложили экономически эффективный метод, который позволяет проследить динамику возникающих адаптивных аллелей SV в экспериментальных эволюционных популяциях. Этот метод сочетает в себе классические методы ПЦР и автоматизированный параллельный капиллярный электрофорез, ч...

Структурные варианты (SV) представляют собой изменения геномной последовательности, обычно влияющие на 50.н. или более. Четыре категории описанных SV — это большие вставки, большие удаления, инверсии и дублирования. До недавнего времени больше внимания уделялось однонуклеотидным вариантам (SNV), чем структурным вариантам, с точки зрения их фенотипических эффектов и их роли в качестве генетических детерминант заболевания или их вклада в адаптацию. Вероятно, это связано с тем, что легче как обнаружить SNV, так и предсказать их фенотипические эффекты. Тем не менее, технологии глубокого секвенирования с коротким и длинным считыванием значительно улучшили обнаружение SV, по крайней мере, в отдельных индивидуумах или клональных геномах1. Параллельно с этим их фенотипические эффекты были лучше охарактеризованы, и было задокументировано множество примеров их влияния в качестве генетических детерминант болезней человека 2,3 или адаптации к новой среде4.
Делеции и вставки, часто вызванные вставками мобильных генетических элементов (MGE), гораздо более разрушительны, чем однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), и приводят к мутациям со сдвигом рамки и модификации структуры белка. Делеции и вставки MGE в генах почти всегда приводят к инактивации генов, а вставки в некодирующие области могут приводить к репрессии или конститутивной экспрессии соседних генов, когда последовательности вставки (IS) содержат промоторные или терминирующие последовательности5. В то время как нокаут основных генов приводит к явным пагубным последствиям для бактериальной приспособленности, потеря второстепенных генов в некоторых случаях полезна. Несмотря на присущие им затраты, дупликации также могут быть полезными и участвовать в адаптации, поскольку они приводят к изменению дозировки генов; Увеличение активности определенного белка может быть полезным в зависимости от условий6.
Микробные экспериментальные эволюционные популяции обычно начинаются с клонов. Это первоначальное отсутствие генетического разнообразия в сочетании с «закрытой средой», характерной для пробирок, приводит к очень ограниченному потенциалу эволюции путем получения генов посредством горизонтального переноса и рекомбинации генов. В этих специфических условиях особенно важен вклад в адаптацию делеций, дупликаций и внутригеномной вставки MGE; бактерии часто приспосабливаются через мутации с потерей функции (в основном из-за делеций или вставок MGE), влияя на гены, которые бесполезны в стабильных, часто богатых питательными веществами, монокультурных искусственных средах7. В самом продолжительном эксперименте по эволюции E. coli вставки IS150 особенно часты среди популяций, эволюционировавших после 50 000 поколений, при этом элементы IS составляют 35% мутаций, которые достигают высокой частоты в популяциях, которые сохраняют частоту мутаций в предковой точке8.
Исследования эволюции и ресеквенирования сочетают экспериментальную эволюцию и технологии секвенирования следующего поколения (NGS) для изучения того, как бактерии адаптируются на фенотипическом и геномном уровнях к различным условиям окружающей среды и стрессам, таким как различные источники углерода и энергии, антибиотики и осмотический стресс 9,10,11 . Эти исследования обычно получают геномную информацию об эволюционировавших популяциях или клонах исключительно в экспериментальной конечной точке, а в некоторых случаях и в ряде промежуточных временных точек12,13,14. Эти данные дают представление о генах и путях, участвующих в адаптации к данной среде, но редко позволяют исследователям проследить динамику de novo возникающих и охватывающих аллелей с течением времени.
Один из подходов к отслеживанию этой динамики состоит в том, чтобы выбрать ограниченное количество сегрегационных аллелей, представляющих интерес (из-за функции генов, на которые они влияют, потому что они проходят параллельно в независимых популяциях и т. д.) и использовать секвенирование ампликонов для количественной оценки доли аллелей, объединяя множество временных точек в одном и том же циклесеквенирования 15. Этот метод был успешно использован для отслеживания динамики вариантов малых размеров (SNP или 1.н.) в экспериментальных16 и естественных17 популяциях микробов. Однако в случае более крупных инделов или вставок MGE разница в размерах ампликонов вызывает различия в эффективности ПЦР, которые искажают взаимосвязь между пропорциями считывания и аллеля. В некоторых случаях разница в размерах между двумя аллелями превосходит классическую длину ампликона. Здесь мы соединили метод триплетной ПЦР с автоматическим параллельным капиллярным электрофорезом для количественной оценки относительной частоты аллеля вставки на основе дискриминации по размерам. Этот подход позволяет использовать недостаточно используемые экспериментальные временные точки для определения динамики возникающего мутантного аллеля и отслеживать его частоту до фиксации или потери экономически эффективным способом. Мы применили этот метод для отслеживания возникающих мутS-аллелей, мутировавших через вставку IS10, обеспечивая мутировавший генотип гипермутаторным фенотипом.
Этот метод требует двух целевых аллелей с разницей в размере ≥5%. Во-первых, триплеты грунтовки предназначены для получения фрагментов одинакового размера, которые имеют общий праймер. Во-вторых, оптимизируются условия ПЦР и строится калибровочная кривая с использованием смесей дикого типа (WT) и мутантной гДНК. Наконец, образцы амплифицируются с помощью ПЦР, а относительная частота каждого аллеля количественно определяется с помощью параллельного количественного капиллярного электрофореза.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

В настоящее время известно, что структурные варианты (SV) (т. е. делеции, вставки, дупликации и инверсии) играют важную роль в фенотипической изменчивости и, следовательно, в таких процессах, как определение заболевания или адаптация к новой среде. Однако однонуклеотидным вариантам уделяется гораздо больше внимания, чем SV, вероятно, потому, что их легче обнаружить, а их фенотипические эффекты легче предсказать. Развитие технологий глубокого секвенирования с короткими и длинными показаниями значительно улучшило обнаружение SV, но количественная оценка их частоты на основе данных объединенного секвенирования (poolseq) по-прежнему технически сложна и дорогостояща.
Здесь мы представляем довольно простой и недорогой метод, который позволяет исследователям проследить динамику частоты аллелей SV. В качестве примера применения мы следуем частоте вставки последовательности вставки (IS) в экспериментальных эволюционных популяциях бактерий. Этот метод основан на проектировании триплетов праймеров вокруг границ структурных вариантов, таким образом, чтобы ампликоны, полученные при амплификации дикого типа (WT) и производных аллелей, отличались по размеру не менее чем на 5% и чтобы их эффективность амплификации была одинаковой. Количество каждого ампликона затем определяется с помощью параллельного капиллярного электрофореза и нормализуется до калибровочной кривой. Этот метод может быть легко распространен на количественную оценку частоты других структурных вариантов (делеций, дупликаций и инверсий) и на подходы пул-секвенирования природных популяций, включая популяции патогенов внутри пациента.

Используя ДНК, извлеченную из предкового клона, и клона гипермутатора, выделенного из популяции S2.11 в поколении 1000, мы установили калибровочную кривую, показанную на рисунке 2. Фактические мутантные пропорции из подготовленных в лаборатории смесей ДНК и измеренные с пом...

Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Мы разработали экономически эффективный метод отслеживания динамики аллелей неоднонуклеотидного полиморфизма, который может быть легко адаптирован к экспериментальным эволюционным замороженным архивам. Метод триплетной ПЦР сочетался с автоматическим параллельным капиллярным электрофорезом для количественной оценки относительной частоты аллеля вставки в ходе экспериментальной эволюции.

Отслеживание динамики структурных вариантов в экспериментально эволюционировавших популяциях

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Структурные варианты, такие как вставки, делеции, дублирования и инверсии, в прошлом было труднее отслеживать экспериментально, и их частоты не могут быть точно измерены с помощью секвенирования ампликонов. Здесь мы предлагаем простой экономически эффективный метод, который объединяет тройной дизайн праймера и параллельный капиллярный электроферез для отслеживания частот аллелей структурных вариантов с течением времени. Этот метод был разработан, чтобы дополнить секвенирование конечных точек в экспериментальной эволюции и проследить частоты возникающих аллелей de novo.Мы надеемся, что этот метод также принесет пользу тем, кто работает с данными о патогенах внутри хозяев. Демонстрировать процедуру будет Жанна Хамет, научный сотрудник нашей лаборатории. Различные этапы методов будут показаны в случае, когда производный аллель является результатом вставки IS10 в бактериальный ген, называемый mutS.Во-первых, разработайте пару праймеров для амплификации короткого ампликона на аллеле дикого типа вокруг места вставки мутантов. Разработайте третий праймер вперед праймер два в последовательности вставки, чтобы получить небольшую переменную размера из ампликона дикого типа. Начните с извлечения ДНК из 24-часовых культур фиксированного дикого типа и мутантных аллельных клонов.После количественного определения ДНК разбавьте каждый экстракт ДНК до пяти нанограммов на микролитр водой. Зафиксируйте два образца в соотношении 50/50. Настройте реакцию объемом 20 микролитров, содержащую 10 нанограммов образца ДНК, праймеров и мастер-смеси для ПЦР.Затем отделяют продукт ПЦР с помощью электрофореза, используя 2%-ный агарозный гель. Разница в размерах между ампликонами дикого типа и мутанта должна быть проверена на геле. Чтобы получить калибровочную кривую, начните со смешивания ДНК дикого типа и мутантной ДНК в различных соотношениях.Разбавьте продукты ПЦР до 0,1 нанограмма на микролитр концентрации. Чтобы приготовить разделительный гель, смешайте свежий гель и краситель. Замените входной буфер.Поместите буфер для полоскания в правильное место ящика прибора для параллельного капиллярного электрофореза. Добавьте 22 микролитра маркера разбавителя в лунки 96-луночной пластины. Теперь добавьте два микролитра разбавленных продуктов ПЦР в каждую лунку образца.К одному Ну, добавьте лестницу размера ДНК из высокочувствительного набора, размером от одной до 6 000 пар оснований. Поместите микропланшет в прибор для параллельного капиллярного электрофореза в выбранном прогоне программного обеспечения прибора. Проанализируйте результаты с помощью программного обеспечения для анализа данных.Во-первых, определите пики на основе их известного размера. Количественно оцените каждый ампликон, чтобы получить калибровочную кривую. Наконец, убедитесь, что относительные количества двух аллелей измерены правильно.Эта калибровочная кривая затем используется для расчета количества структурных вариантов после амплификации ПЦР и параллельного капиллярного электрофореза. Эти репрезентативные результаты следуют за разрушительной вставкой в ген mutS. Нокдауны и mutS приводят к фенотипу гипермутатора, позволяя бактериям отбирать больше мутаций, чем их базовая частота мутаций.С помощью представленного метода отслеживалась частота структурных вариантов mutS на протяжении 1000 поколений. Выявлена немонотонная траектория формирующегося мутантного аллеля. Мутантный аллель был впервые обнаружен в поколении 680.Затем аллель быстро увеличился в частоте, достигнув 67% к поколению 713. Затем это увеличение застопорилось, увеличившись всего на 10% в течение следующих 53 поколений, до 76%Неожиданно частота мутантных аллелей затем снизилась с 76% до 49% в течение 13 поколений, после чего она увеличилась до фиксации. Этот метод принесет пользу тем, кто работает над экспериментальной эволюцией.Этот протокол позволяет пользователю брать замороженные архивы и исследовать эволюционные траектории, которые в противном случае невозможно наблюдать с помощью данных секвенирования конечных точек.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Получение высокого качества РНК от единичных клеточных популяций в тканях человека Мозг Посмертные

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Оценка пространственного распределения γH2AX следующие ионизирующих излучений

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Фотообесцвечивания Анализы (FRAP и FLIP), чтобы измерить хроматина Динамика белков в живых эмбриональных стволовых клеток

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Изучение Протеолиз циклин B на одном уровне клеток в популяции клеток Всего

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Селективный захват 5-hydroxymethylcytosine из геномной ДНК

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Прочная 3D рыбу ДНК с использованием меченых зондов непосредственно

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Кусочек Культура Метод После Развитие Зуб микробов в эксплантата культуры

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Изоляция потенцированной Hsp104 вариантов Используя дрожжи Proteinopathy Модели

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Изучение рибонуклеотид включение: Обнаружение Strand конкретных Ribonucleotides в геноме дрожжей и измерения рибонуклеотид индуцированного мутагенеза

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...